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Articles by Uttiya Basu in JoVE
JoVE Immunology and Infection
Produzione ricombinante retrovirali e infezione delle cellule B
1Department of Microbiology and Immunology, Columbia University College of Physicians and Surgeons, 2Herbert Irving Comprehensive Cancer Center, Columbia University
Un efficiente sistema di struttura e analisi funzionale di un gene in un
Other articles by Uttiya Basu on PubMed
La Fosforilazione Del Fattore Di Iniziazione Dei Mammiferi Traduzione Negli Eucarioti 6 E Suo Omologo Cerevisiae Saccharomyces Tif6p: La Prova Che La Fosforilazione Della Tif6p Regola La Sua Distribuzione Nucleo-citoplasmatici Ed è Necessaria Per La Crescita Delle Cellule Di Lievito
La sintesi della subunità ribosomiale 60S in Saccharomyces cerevisiae richiede Tif6p, l'omologo di lievito del fattore di iniziazione dei mammiferi traduzione negli eucarioti 6 (eIF6). Nel presente lavoro, abbiamo isolato una proteina chinasi da lisati dei reticolociti di coniglio sulla base della sua capacità di fosforilare eIF6 umana ricombinante. Analisi di spettrometria di massa, come pure la proprietà antigeniche purificate della chinasi di identificato come chinasi della caseina io. Il sito di fosforilazione in vitro, che è altamente conservata dal lievito ai mammiferi, è stato identificato come i residui di serina a posizioni 174 (sito principale) e 175 (sito minore). La proteina di lievito omologo Tif6p era anche fosforilata in vivo nelle cellule di lievito. Mutazione di Tif6p a serina-174 di alanina ridotto drasticamente la fosforilazione e causato perdita di crescita delle cellule e di vitalità. Quando sia Ser-174 e Ser-175 sono stati mutati in alanina, fosforilazione della Tif6p è stata abolita completamente. Inoltre, mentre il selvaggio-tipo Tif6p è stato distribuito sia in nuclei e il citoplasma delle cellule di lievito, il mutante Tif6p (con Ser174Ala e Ser175Ala) è diventato una proteina costitutivamente nucleare. Questi risultati suggeriscono che phosphorylatable Ser-174 e 175 Ser gioca un ruolo critico nell'esportazione nucleare di Tif6p.
L'enzima Di Diversificazione Degli Aiuti Dell'anticorpo è Regolato Da Fosforilazione Di Proteina Chinasi A
Anticorpi, che sono prodotte dalle cellule di B-lineage, costituiti da pesanti dell'immunoglobulina (IgH) e catene (IgL) che hanno le variabili regioni amino-terminale e carbossi-terminale costante di luce. In risposta agli antigeni, le cellule B subiscono due tipi di alterazioni genomiche per aumentare la diversità dell'anticorpo. Affinità per l'antigene può essere aumentato dall'introduzione di mutazioni puntiformi nelle regioni variabile di IgH e IgL di ipermutazione somatica. Inoltre, funzioni effettrici anticorpo possono essere modificate cambiando gli esoni di regione costante IgH espressi attraverso la ricombinazione di IgH classe switch (CSR). Ipermutazione somatica e CSR entrambi richiedono B-cellula-specifica indotta da attivazione citidina deaminasi proteina (aiuto), che avvia queste reazioni attraverso il suo single-stranded (ss)-DNA-specifici attività di citidina deaminasi. Nelle analisi biochimiche, replication protein A (RPA), un ssDNA-binding protein, associa aiuto fosforilata da cellule B attivate e migliora attività aiuto su trascritto double-stranded (ds) DNA contenente somatic hypermutation o CSR target sequenze. Questa associazione di aiuto-RPA, che richiede la fosforilazione, può fornire un meccanismo per consentire aiuti agli obiettivi dsDNA accesso in cellule B attivate. Qui vi mostriamo che aiuti da cellule B sono fosforilato su un sito di consenso della proteina chinasi A (PKA) e che la PKA è la chinasi aiuto fisiologica. Così, gli aiuti da cellule non-linfoidi possono essere fosforilato funzionalmente da ricombinante PKA per consentire l'interazione con RPA e promuovere la deaminazione di dsDNA trascritto substrati. Inoltre, mutazione del sito di fosforilazione di PKA principale degli aiuti mantiene attività deaminazione ssDNA, ma riduce notevolmente attività di deaminazione dsDNA RPA-dipendente e danneggia gravemente la capacità degli aiuti di effetto CSR in vivo. Concludiamo che PKA ha un ruolo critico nella alberino-di traduzione regolamento delle attività di aiuto nelle cellule B.
AIUTO Nella Classe Switch Ricombinazione E Ipermutazione Somatica
Ipermutazione somatica e classe-interruttore-ricombinazione vengono avviate dalla deaminazione del deoxycytosine nel DNA di attivazione-indotta-deaminasi, aiuto. Recentemente, c'è stata molta ricerca in quanto gli obiettivi degli aiuti double-stranded DNA in regioni dei geni Ig, il coinvolgimento dei cofattori e modifiche di posttranslational in questo processo, la cooptazione del DNA 'riparazione' meccanismi e l'evoluzione degli aiuti.
Regolamento Di Attivazione Indotta Deaminasi Tramite Fosforilazione
Diversificazione di immunoglobulina gene di ipermutazione somatica (SHM), conversione di ricombinazione (RSI) e gene interruttore classe dipende da deaminasi attivazione indotta citidina (aiuto). AIUTO è di una single-stranded DNA specifico citidina deaminasi che si esprime principalmente nei linfociti B maturi attivati. AIUTO sembra catalizzano la deaminazione citidina DNA di pesante dell'immunoglobulina (IgH) e catena leggera (IgL) regione variabile (V) esoni e IgH switch (S) regione sequenze per avviare, rispettivamente, IgH e IgL ipermutazione somatica (SHM) e IgH classe switch ricombinazione (CSR). Qui, discuteremo le implicazioni dei recenti studi che dimostrano il ruolo della fosforilazione di aiuto nell'aumentare l'attività di aiuto nei confronti di questi due processi.
Evoluzione Della Classe Catena Pesante Dell'immunoglobulina Interruttore Meccanismo Di Ricombinazione
Per montare una risposta immunitaria ottima, linfociti B maturi possono cambiare la classe di anticorpi espressa da IgM IgG, IgA, o IgE attraverso un processo di ricombinazione/eliminazione chiamato ricombinazione (CSR) di switch della classe del catene pesanti (IgH) immunoglobuline. CSR richiede la deaminasi attivazione indotta citidina (aiuto), che ha dimostrata di impiegare single-stranded DNA come substrato in vitro. IgH CSR si verifica all'interno e richiede sequenze ripetitive, grandi, chiamate regioni S, che sono parti di germe linea trascrizione unità (definito "C(H) geni") che sono composte da promotori, S regioni e singoli esoni di IgH regione costante. CSR richiede ed è diretto da trascrizione linea germinale dei geni C(H) partecipanti prima della RSI. Deaminazione degli aiuti di cytidines nelle regioni S sembra portare a si S regione double-stranded rompe (DSBs) necessari per avviare la CSR. Unione di due regioni S rotte per completare CSR sfrutta l'attività dei meccanismi di riparazione del DNA DSB generali. In questo capitolo, discuteremo la nostra attuale conoscenza della funzione delle regioni S, trascrizione di linea germinale, aiuti e DNA repair in CSR. Vi presentiamo un modello per la RSI in cui trascrizione attraverso regioni S fornisce substrati di DNA su quale aiuto può generare lesioni che inducono DSB. Discutiamo anche come fosforilazione degli aiuti possa mediare le interazioni con i cofattori che facilitano l'accesso alle regioni S trascritti durante la RSI e trascritti regioni variabili durante il relativo processo di ipermutazione somatica (SHM). Infine, nel contesto di questo modello CSR, abbiamo ulteriormente discutere risultati attuali che suggeriscono synapsis ed entrare a far parte della regione S DSBs durante la RSI si sono evoluti per sfruttare i meccanismi generali che funzione di aderire ampiamente separati DSBs cromosomiche.
Il Saccharomyces Cerevisiae 60 S Ribosoma Biogenesi Fattore Tif6p è Regolato Dalla Fosforilazione Mediata Da Hrr25p
La biosintesi di 60 subunità ribosomiale S in Saccharomyces cerevisiae richiede Tif6p, l'omologo di lievito di eIF6 dei mammiferi. Questa proteina è necessaria per la formazione di 60 subunità ribosomiale S perché è indispensabile per l'elaborazione di 35 S pre-rRNA per il maturo 25 S e 5,8 S i rRNAs. Nel presente lavoro, mediante analisi biochimiche e genetiche molecolare, mostriamo che Hrr25p, un'isoforma della chinasi della caseina lievito, tirosine Tif6p sia in vitro che in vivo. Triptico fosfopeptide mapping of in vitro fosforilato Tif6p da Hrr25p e (32) P-etichetta Tif6p isolato da cellule di lievito, seguite da analisi di spettrometria di massa ha rivelato che la fosforilazione si è verificato su un singolo peptide triptico a Ser-174. Saccarosio gradienti frazionamento e coimmunoprecipitation esperimenti dimostrano che una piccola ma significativa frazione di Hrr25p è associata a 66 particelle preribosomal S che contengono anche Tif6p associato. Deplezione di Hrr25p da un mutante condizionale lievito che non riesce a fosforilare Tif6p fu in grado di elaborare in modo efficiente, pre-i rRNAs con conseguente significativa riduzione nella formazione di 25 S rRNA. Questi risultati insieme ai nostri precedenti osservazioni che Ser-174 phosphorylatable è necessaria per la crescita delle cellule di lievito e redditività, suggeriscono che la fosforilazione mediata da Hrr25p di Tif6p gioca un ruolo critico nella biogenesi di 60 S subunità ribosomiale in cellule di lievito.
Evoluzione Del Regolamento Di Fosforilazione-dipendente Della Deaminasi Attivazione Indotta Citidina
Interazione della deaminasi attivazione indotta citidina (aiuto) con replication protein A (RPA) è stato proposto per promuovere l'accesso degli aiuti al trascritto double-stranded (ds) DNA durante la catena chiara dell'immunoglobulina e catena pesante Classe switch ricombinazione (CSR). Interazione del mouse aiuti (cameriera) con RPA e deaminazione dsDNA dipendente dalla trascrizione in vitro richiede fosforilazione A (PKA) della chinasi di proteina a serina 38 (S38) e cameriera normale attività CSR dipende S38. Tuttavia, zebrafish aiuti (zAID) catalizza robusto CSR in cellule di topo nonostante manca un sito equivalente S38 PKA. Qui, vi mostriamo che quello aspartato 44 (D44) in zAID fornisce una funzionalità simile in vitro e in vivo come cameriera S38 fosforilazione. Inoltre, introduzione di un sito PKA un mutante D44 zAID fatto PKA dipendente per attività in vitro e ripristinata la normale attività di RSI. Sulla base di questi risultati, abbiamo generato mutanti cameriera che funzionano allo stesso modo indipendentemente dalla fosforilazione S38. Confronto dei pesci ossei versus anfibi e mammiferi AIDs suggerisce divergenza evolutiva da costitutiva di interazione regolata PKA RPA/aiuto.
Alberino-di Traduzione Regolamento Della Deaminasi Attivazione Indotta Citidina
I geni per l'immunoglobulina assemblati nelle cellule B di topi e gli esseri umani sono alterati da processi distinti noti come ricombinazione switch di classe (CSR) e ipermutazione somatica, che conduce alla diversificazione del repertorio anticorpale. Questi due processi di modificazione del DNA sono iniziati delle specifiche delle cellule di B proteina fattore indotta da attivazione citidina deaminasi (aiuto). AIUTO traduzionali viene modificato da fosforilazione in diversi siti, anche se il significato funzionale durante la RSI è stata coinvolta solo per fosforilazione in serina-38 (S38). Anche se più laboratori hanno dimostrato che la funzione di aiuto è regolata tramite fosforilazione a S38, il preciso ruolo biologico di S38 fosforilazione è stato un argomento di dibattito. Qui, si discute la nostra interpretazione del significato del regolamento gli aiuti tramite la fosforilazione e discutere anche di come questa forma di regolamento aiuti potrebbe essersi evoluto negli organismi superiori.
L'integrità Del Sito Di Fosforilazione Della Serina-38 Aiuto è Fondamentale Per Ricombinazione Switch Di Classe E Ipermutazione Somatica Nei Topi
Deaminasi attivazione indotta citidina (aiuto) è un single-stranded (ss) specifici del DNA deaminasi della citidina che avvia Ig catene pesanti (IgH) classe switch ricombinazione (CSR) e Ig ipermutazione somatica (SHM) da deaminante cytidines entro, rispettivamente, IgH interruttore (S) regioni ed esoni regione variabile (V) Ig. AIUTO che viene fosforilato sul residuo di serina 38 interagisce con replication protein A (RPA), una proteina ssDNA, per promuovere la deaminazione di DNA double-stranded trascritto in vitro, che, insieme ad altre prove, suggerisce che aiuti similmente possono avere accesso alle regioni S trascritti ed esoni V in vivo. Tuttavia, è stato dibattuto il ruolo fisiologico della fosforilazione di aiuti a residui serina 38 (S38) e anche l'obbligo per il residuo S38, rispetto alla RSI o SHM. Per risolvere questo problema, abbiamo usato gene targeting per generare un locus aiuto del mouse endogeno che produce gli aiuti in cui S38 viene sostituito con alanina (AID(S38A)), una forma mutante di aiuto che mantiene l'attività catalitica simile su ssDNA come aiuto WT (AID(WT)). B cellule omozigoti per la mutazione AID(S38A) mostrano sostanzialmente alterata CSR e SHM, correlando con incapacità di AID(S38A) per interagire con RPA endogeno. Inoltre, topi haploinsufficient per AID(S38A) hanno ancor più gravemente compromessa CSR rispetto ai topi haploinsufficient per AID(WT), con livelli CSR ridotti a livelli quasi di fondo. Questi risultati dimostrano inequivocabilmente che l'integrità del sito aiuto S38 fosforilazione è necessaria per normale CSR e SHM nei topi e fortemente sostenere un ruolo per la fosforilazione di aiuto all'interazione S38 e RPA nella regolazione della RSI e SHM.
Regolamento Di Attivazione Indotta Citidina Deaminasi Deaminazione Attività DNA in Cellule B Da Fosforilazione Ser38
Umano e geni Ig del mouse sono diversificate nei linfociti B maturi da processi distinti conosciuti come Ig catena pesante CSR (ricombinazione switch di classe) ed esone variabile-regione di Ig SHM (ipermutazione somatica). Questi processi di modificazione del DNA sono iniziati dagli aiuti (deaminasi della citidina attivazione indotta), un deaminasi citidina DNA espressa prevalentemente in cellule B attivate. AIUTO post-transcriptionally è regolata tramite meccanismi multipli, compresi regolamento microRNA, nucleo-citoplasmatici spola, ubiquitination e fosforilazione. Tra questi processi normativi, la fosforilazione di aiuto a Ser(38) è stato un focus di studio particolarmente intenso e di dibattito. Nel presente documento, si parlerà di recenti studi biochimici e mouse genetici che iniziano per chiarire il significato funzionale di fosforilazione di aiuto Ser(38) nel contesto dell'evoluzione di questa modalità di regolamento degli aiuti e i ruoli potenziali che possono giocare in B-cellule attivate durante una normale risposta immunitaria.
Il RNA Exosome Obiettivi La Deaminasi Della Citidina Aiuti a Due Filoni Di Trascritti Substrati Duplex Di DNA
Deaminasi attivazione indotta citidina (aiuto) avvia immunoglobuline (Ig) catene pesanti (IgH) classe switch ricombinazione (CSR) e Ig regione variabile ipermutazione somatica (SHM) nei linfociti B deammina cytidines sul modello e non template ciocche di substrati DNA trascritti. Tuttavia, il meccanismo di accesso aiuti a filo del DNA template, particolarmente quando ibridato a una trascrizione di RNA nascente, è stato un enigma. Abbiamo ora coinvolgono il RNA exosome, un complesso RNA-elaborazione/degradazione cellulare, in aiuto di targeting di due filamenti di DNA. In cellule di lignaggio B attivate per la RSI, il RNA exosome associa gli aiuti, si accumula sulle regioni switch IgH in maniera aiuto-dipendente ed è necessaria per la RSI ottimale. Inoltre, sia il cellulare RNA exosome complesso e un nucleo di exosome RNA complesso ricombinante impartire deaminazione DNA robusto aiuto - e trascrizione-dipendente di due fili di substrati SHM trascritti in vitro. I nostri risultati rivelano un ruolo per macchinari di sorveglianza RNA non codificante nel generare diversità dell'anticorpo.
Il Fattore Di Trascrizione BATF Controlla I Regolatori Globali Della Classe-interruttore Ricombinazione in Entrambe Le Cellule B E Le Cellule T
Il fattore di trascrizione BATF controlla la differenziazione dell'interleuchina-17 (IL 17)-produzione di cellule T helper (cellule T (H) 17) regolando l'espressione del fattore di trascrizione RORγt stessa e RORγt target geni come Il17. Qui riportiamo il meccanismo da cui BATF controlli in vivo classe-interruttore di ricombinazione (CSR). Nelle cellule T, espressione di BATF direttamente controllata della trascrizione fattori Bcl-6 e c-Maf, entrambi i quali sono necessari per lo sviluppo di cellule T helper follicolari (cellule T(FH)). Ripristinare l'attività delle cellule T(FH) Batf(-/-) T cellule in vivo necessaria coexpression di Bcl-6 e c-Maf. Nelle cellule B, BATF controllato direttamente l'espressione di entrambi deaminasi della citidina indotta da attivazione (aiuto) e di trascrizioni germinale della frapposizione regione della catena pesante e costante pesante catena regione (I(H)-C(H)). Così, funzioni di BATF a più livelli gerarchici in due tipi di cellule per regolare globalmente risposte anticorpali commutata in vivo.
