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Articles by Valerica Raicu in JoVE
JoVE General
Quantificazione in vivo di G interazioni proteina recettore accoppiato con spettralmente risolte microscopia a due fotoni
1Department of Physics, University of Wisconsin - Milwaukee, 2Department of Biological Sciences, University of Wisconsin - Milwaukee
Utilizzando un spettralmente risolta a due fotoni sistema di imaging microscopia, a livello di pixel mappe di Förster Resonance Energy Transfer (FRET) efficienze sono ottenute per le cellule che esprimono recettori di membrana ipotizzato per formare omo-oligomeriche complessi. Dal FRET mappe efficienza, siamo in grado di stimare le informazioni stechiometrico sui complessi oligomeri in fase di studio.
Other articles by Valerica Raicu on PubMed
Edaravone E Argatroban Combinato Causato Neuroprotezione Additivo Contro 15 Min Di Ischemia Proencefalo Di Gerbilli
Abbiamo valutato se o non una combinazione degli scavenger di radicali liberi, edaravone (MCI-186), l'inibitore selettivo della trombina e argatroban migliora postischemic hypoperfusion e diminuisce la mortalità dopo 15 min di ischemia proencefalo nel gerbillo. Argatroban o edaravone da solo in modo significativo aumento del flusso sanguigno cerebrale postischemic e attenuato edema cerebrale dopo riperfusione. Tuttavia, solo la combinazione aumentato il rapporto di sopravvivenza (P < 0.05 di Mantel-Cox) e protetto il danneggiamento delle cellule neuronali. Il presente studio indica che anticoagulanti e antiradicali liberi funzionano reciprocamente per inibire la progressione del danno ischemico cellulare e che una combinazione di questi tipi di farmaci contribuirà a migliorare i risultati dopo ischemia cerebrale.
Ischemia Acuta Provoca 'oscura Cella' Modifica Delle Cellule Marginali Realizzate Nella Coclea Gerbillo
La cocleare stria vascularis produce il endolymph e genera il endocochlear DC potenziali, due ingredienti indispensabili di un processo di trasduzione uditiva. La cellula marginale, tra i diversi tipi di cellule che costituiscono la stria vascularis, viene chiamata 'la cella oscura' sulla base del suo aspetto da microscopia elettronica della trasmissione (TEM). Per chiarire se questo comunemente osservato 'aspetto oscuro' è una caratteristica normale delle cellule marginali, come ipotizzato nella letteratura, o un artefatto sperimentale, abbiamo sviluppato un metodo di fissazione in vivo per minimizzare i danni del tessuto ischemico. Mentre in circolazione sistemica sostenuta con sangue ossigenato, la stria vascularis di gerbilli chimicamente è stato fissato dalla perfusione perilinfatica con un fissativo e la stria vascularis fu osservato da TEM. In contrasto con un numero di precedenti relazioni, il citoplasma delle cellule marginali non era buio, e analisi quantitativa ha mostrato che la differenza tra la densità dell'elettrone citoplasmatica delle cellule marginali e quella delle cellule intermedie (un altro tipo di cellule realizzate) non era statisticamente significativa. Per confronto, i gerbilli furono autorizzati a sottoporsi a 3 min di ischemia dopo la decapitazione. In queste condizioni, cellule marginali ha mostrato il tipico 'aspetto scuro', come riportato in precedenza, e loro densità dell'elettrone citoplasmatica era 1,7 volte superiore a quella delle cellule intermedie. Inoltre, il volume dei mitocondri nelle cellule marginali in fase 3 min di ischemia è stato superiore a quello fissato in vivo. Pertanto, possiamo concludere che l'aspetto ampiamente riconosciuto 'oscura cella' di cellule marginali seguendo le procedure di fissaggio convenzionale riflette la lesione delle cellule a causa di ischemia, che è inerente le procedure di fissaggio standard, ma può essere evitato dal nostro protocollo di fissazione qui introdotto.
Interazione Proteina Quantificato in Vivo Per Il Trasferimento Di Energia Di Risonanza Di Fluorescenza Spettralmente Risolto
Descriviamo un trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza (FRET)-basato su metodo per trovare nelle cellule viventi la frazione di una popolazione di proteina (alpha(T)) formando complessi e il numero medio (n) di quelle molecole proteiche in ogni complesso. Il metodo si basa sia sulle emissioni sensibilizzate accettore e donatore de-quenching (da photobleaching delle molecole del ricettore), accoppiato con analisi spettrale completa della firma del differenziale fluorescenza, al fine di quantificare il trasferimento di energia donor/acceptor. I limiti di sensibilità e approccio sono adatti per indagini microscopiche in vivo. Questo è dimostrato utilizzando un microscopio confocale a scansione laser per studiare la formazione dei complessi della proteina del recettore alfa-fattore 2 sterile (Ste2p), etichettata con le proteine fluorescenti verde, ciano e gialle (GFP, CFP e YFP rispettivamente), nel lievito gemmante Saccharomyces cerevisiae. Un modello teorico è presentato che riguarda l'efficienza di trasferimento di energia nelle popolazioni di proteina (l'apparente efficienza FRET, E(app)) l'energia trasferita in una coppia singola donor/acceptor (E la vera efficienza FRET). Abbiamo determinato E utilizzando un nuovo metodo che si basa su misurazioni E(app) per due coppie di donor/acceptor, Ste2p-CFP/Ste2p-YFP e Ste2p-GFP/Ste2p-YFP. Da E(app) ed E abbiamo determinato alpha(T) circa 1 e n 2 circa per Ste2 proteine. Poiché in assenza di ligando nei nostri esperimenti si formano i complessi Ste2p, possiamo concludere che il fattore-alfa feromone non è necessario per la dimerizzazione.
Determinazione Dell'energia Di Legame Fe-CO Nella Mioglobina Usando La Spettroscopia Grigliato Fase Termica Transitoria Dell'eterodina-rilevato
Le energie di legame a siti attivi delle proteine sono intimamente Unite al rapporto struttura-funzione nei sistemi biologici. A causa della natura sconosciuta del rilassamento della proteina lungo una coordinata di reazione, non è possibile determinare direttamente le energie di legame pertinenti alla funzione della proteina. Incorporando le proteine in vetri di trealosio, è possibile congelare fuori relax proteina su scale temporali brevi e determinare le energie di legame dei ligandi photolabile mediante Spettroscopie fototermica. Come un esempio di prototipo, la fotolisi dinamica ed energetica di carboxy-mioglobina (MbCO) in una matrice di vetro trealosio a temperatura ambiente sono stati studiati da assorbimento transiente (o pompa-sonda) e transitori termici fase grigliato spettroscopia per determinare le dinamiche di ricombinazione CO e associati energetica, rispettivamente. Sia l'iniziale energetica dei bond di rottura e l'energia rilasciata su riforma bond potrebbe essere utilizzato, su una scala di tempo più veloce di rilassamento significativo della proteina, per determinare l'energia di legame Fe-CO come 34 + /-4 kcal/mol. Questa energia di legame è significativamente più grande di quello che in genere citati (25 kcal/mol) in base a misurazioni indirette ma è in buon accordo con le previsioni teoriche recenti (35 kcal/mol) (Rovira, C.; Parrinello, M. int J. Quantum Chem 2000, 80, 1172). Questo risultato in combinazione con lo studio teorico suggerisce che la struttura della proteina gioca un ruolo significativo nelle energie di legame a siti attivi che a sua volta fornisce un elemento di sintonia delle altezze efficace barriera indipendenti nella regione dello stato di transizione.
Efficienza Di Trasferimento Di Energia Per Risonanza in Homo-oligomerici Complessi Di Proteine
Un modello teorico è proposto per l'apparente efficienza di fluorescenza (Förster) resonance energy transfer (FRET) in miscele di monomeri liberi e complessi della proteina oligomerica homo di dimensione uniforme. Il modello prende in percorsi possibili conto per il trasferimento di eccitazioni ottici da singoli donatori per più accettori e donatori multipli (non simultaneamente) a singoli accettori. Questa partenza necessaria dalla teoria standard è stato suggerito in letteratura, ma è solo stato correttamente implementato per alcuni casi particolari, come ad esempio per particolari geometrie degli oligomeri. Le previsioni del presente modello teorico sono notevolmente diversi da quelli della teoria standard, fatta eccezione per il caso di dimeri, per i quali l'accordo è osservato. Questo modello prevede quindi nuove intuizioni sul comportamento di oligomeri composto da più di due monomeri FRET e propone anche il mezzo per determinare la dimensione dei complessi della proteina oligomerica, nonché la percentuale di monomeri associati e non associati.
Implementazione Di Una Matrice a Veloce Riconfigurabile Per La Caratterizzazione Dell'impedenza Dei Tessuti
Varie proprietà del tessuto sono stati utilizzati in passato e presente come metriche che possono servire a discriminare sano dal tessuto malato. Assorbimento elettromagnetico (di segnali ottici e raggi x), la dispersione della luce vicino infrarosso e impedenza elettrica sono pochi tali parametri. Al fine di servire come discriminanti per malati (ad es., neoplastiche) tessuto, le caratteristiche di questi tessuti in primo luogo deve essere precisamente determinato. In questa carta, prendere in considerazione le proprietà elettriche impedenza dei tessuti e delle cellule aggregati e presentare il disegno di un array riconfigurabile elettrodo che è in grado di fornire una ben definita interfaccia elettromagnetica al tessuto in fase di studio, per la caratterizzazione nell'intervallo 0.01-30 MHz. La configurazione di elementi della matrice può essere cambiata facilmente sotto controllo digitale, che permette varie configurazioni di campo elettromagnetico essere applicato al tessuto in fase di studio. La matrice è progettata per interfacciarsi con strumentazione di impedenza del quattro-punto, così come i due punti e può essere utilizzata per i sistemi bidimensionali Bioimmagini basati su impedenze elettriche. Il design può essere scalato a frequenze più alte e più piccole dimensioni, permettendo di studi delle proprietà elettriche a livello cellulare.
Monitoraggio in Tempo Reale Del Due-fotone Fotopolimerizzazione Per Uso Nella Fabbricazione Di Dispositivi Microfluidici
Riportiamo un metodo migliore per la produzione dei maestri dispositivo microfluidico utilizzando due-fotone fotopolimerizzazione del photoresist negativo SU-8, che si basa su un microscopio del due-fotone (TPM) comunemente utilizzato nell'imaging dei campioni biologici. I maestri del dispositivo servono come strutture di rilievo negativo per dispositivi microfluidici basati su polidimetilsilossano. Abbiamo osservato che non solo ha fatto l'eccitazione del due-fotone del photoresist SU-8 avviare reticolazione del materiale nella regione della messa a fuoco del raggio laser infrarosso vicino (come previsto) ma ha anche provocato nell'emissione di fluorescenza nella gamma visibile. Le emissioni rilevate di photoresist SU-8 in fase di eccitazione del due-fotone visualizzata una forte correlazione con la dimensione degli oggetti polimerizzati prodotte durante l'esposizione; Questo ha permesso l'avanzamento del processo di produzione master microfluidica essere monitorate in tempo reale. Noi di dimostrare l'uso della rilevazione a fluorescenza durante la fotopolimerizzazione del due-fotone nella produzione di dispositivi microfluidici, che sono stati progettati per intrappolare le cellule di lievito individuali per essere imaged con il TPM stesso utilizzato per la microfluidica master scrittura.
Dimensione Oligomerica Del Recettore Muscarinico M2 in Cellule Vive, Come Determinato Dal Trasferimento Di Energia Per Risonanza Fluorescenza Quantitativa
Energia di risonanza di fluorescenza transfer (FRET), misurata da microscopia di fluorescenza basati su intensità e fluorescenza lifetime imaging, è stato utilizzato per stimare le dimensioni di oligomeri formata dal recettore colinergico muscarinico M(2). L'approccio è basato sul rapporto tra l'apparente efficienza FRET entro un oligomero di dimensione specificata (n) e l'efficienza FRET coppie tra un singolo donatore e un accettore singola (E). Il recettore M(2) è stato fuso al capolinea N di avanzata proteina fluorescente verde o giallo ed espresso in cellule di ovaio di criceto cinese. Spettri di emissione sono stati analizzati da spettrale deconvoluzione, e apparente efficienza sono stato stimato mediante emissione di dequenching donatore e accettore-sensibilizzato a differenti rapporti di enhanced giallo fluorescente protein-M(2) recettore recettore avanzato protein-M(2) verde fluorescente. I dati sono stati interpretati in termini di un modello che considera tutte le combinazioni del donatore e accettore all'interno di un oligomero specificato per ottenere valori muniti di E come segue: n = 2, 0.495 + 0.019; n = 4, 0.202 + /-0.010; n = 6, 0.128 + /-0.006; n = 8, 0.093 + /-0.005. L'efficienza FRET pairwise determinato indipendentemente da formazione immagine di corso della vita di fluorescenza era 0,20-0,24, identificando il recettore M(2) come un tetramero. La strategia descritta qui produce una stima esplicita di oligomerici dimensione in base alle proprietà di fluorescenza da solo. Sua applicazione più ampio potrebbe risolvere la questione generale se recettori accoppiati a proteine G esistano come dimeri o oligomeri più grandi. La dimensione di un oligomero ha implicazioni funzionali, e tali informazioni possono essere previsto a contribuire alla comprensione del processo di segnalazione.
Spettroscopia Dielettrica Bidimensionale: Implementazione E Validazione Di Una Scansione Sonda Coassiale a Tempo Indeterminato
Spettroscopia dielettrica è un potente strumento per la caratterizzazione e classificazione dei materiali in base alle loro proprietà elettriche. Al fine di effettuare le misurazioni dielettriche su un campione con proprietà spazialmente diverse, la sonda di misura in genere viene riposizionata manualmente sulla superficie del campione per ogni misurazione. In questo articolo, vi presentiamo una tecnica romanzo, basata su una matrice multielectrode riconfigurabile, che facilita la registrazione delle misurazioni alle varie posizioni spaziali differenti senza spostare fisicamente gli elettrodi di misura. Elettronicamente selezionando uno degli elettrodi come la linea interna e collegando il resto degli elettrodi insieme per formare la linea esterna, viene creata una sonda coassiale a tempo indeterminato, che può essere riposizionato semplicemente selezionando combinazioni differenti degli elettrodi; da qui il nome di una sonda coassiale "itinerante". Il fattore geometrico, o la costante di cella, di ogni sonda coassiale nella matrice è stato stimato da misurazioni su soluzioni saline con note caratteristiche elettriche. Al fine di convalidare l'installazione per la misura delle proprietà dielettriche di cellule biologiche, la capacità della membrana plasmatica e citoplasma conducibilità delle cellule di lievito sospesi in soluzioni acquose erano misurati e rispetto ai risultati da rapporti pubblicati. Imaging di spettroscopia dielettrica è stato effettuato su fantasmi di tessuto composto da un gel di agar con inclusioni costituito da sospensioni di cellule di lievito concentrato. Le misurazioni sono state eseguite sui fantasmi, e i dati dielettrici sono stati mappati spazialmente rispetto alla posizione degli elettrodi. I dati elettrici spaziali correlato appunto con le posizioni di inclusioni di cellule di lievito entro i fantasmi.
Confronto Tra Intera Distribuzione Media Base E Approcci Per La Determinazione Dell'efficienza Di Trasferimento Del Energia Di Risonanza Di Fluorescenza in Insiemi Di Proteine in Cellule Viventi
Attuali metodi di analisi dei dati provenienti da studi di interazioni proteina-proteina mediante fluorescenza resonance energy transfer (FRET) è emerso da diversi decenni di ricerca utilizzando microscopi wide-field e spettrofluorimetri per misurare la fluorescenza da singole celle o popolazioni di cella. Inerente alla maggior parte delle misurazioni è una media delle distribuzioni di FRET efficienze sopra grandi popolazioni dei complessi della proteina, che lava le informazioni riguardanti la stechiometria e la struttura dei complessi della proteina. Sebbene l'introduzione della scansione laser microscopi in linea di principio potrebbero facilitare la quantificazione delle distribuzioni di FRET efficienze in cellule vive, solo relativamente di recente ha fatto questo potenziale completamente materializzare, attraverso lo sviluppo di approcci spettrale o vita-based. Per sfruttare questa nuova opportunità in imaging molecolare, è necessario sviluppare ulteriormente i modelli teorici e metodi di analisi dei dati. Mediante simulazioni Monte Carlo, abbiamo studiato FRET in omogenei e disomogeneo distribuzioni spaziali di molecole. I nostri risultati indicano che un'analisi basata sulle distribuzioni di FRET efficienze presenta vantaggi significativi rispetto l'approccio basato su media, che includono l'autorizzazione per la corretta identificazione della FRET biologicamente rilevanti. Questo studio fornisce intuizioni l'effetto dell'affollamento molecolare sul tasto, e offre una base per l'estrazione di informazioni da distribuzioni di FRET efficienza utilizzando il raccordo dei dati basati su simulazioni.
