Translate this page to:
Japanese
In JoVE (1)
Other Publications (19)
- Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America
- The EMBO Journal
- Organic Letters
- The EMBO Journal
- Neuron
- Protein Science : a Publication of the Protein Society
- Chembiochem : a European Journal of Chemical Biology
- Organic Letters
- Nature Neuroscience
- Advances in Protein Chemistry
- Structure (London, England : 1993)
- Biochemistry
- Organic Letters
- Cell
- Nature Structural & Molecular Biology
- Protein Science : a Publication of the Protein Society
- Applied Psychophysiology and Biofeedback
- Molecular Cell
- BMB Reports
Automatic Translation
This translation into Japanese was automatically generated.
English Version | Other Languages
Articles by William Barton in JoVE
JoVE General
イメージングタンパク質間相互作用 in vivoで
Biochemistry and Molecular Biology, Virginia Commonwealth University
このプロトコルは、FRETに基づく近接アッセイを使用してどのようにイメージタンパク質間相互作用について説明します。
Other articles by William Barton on PubMed
構造ベースNucleotidylyltransferaseエンジニアリング経由拡大ピリミジンDiphosphosugarライブラリ
試験管 "glycorandomization"で天然物の足場に基づいて、グリコシル化された生体分子の多様なライブラリを生成するための化学酵素的なアプローチである。この技術は、代謝物のグリコシル化に影響を及ぼす特定の酵素の工学的変種、特にnucleotidylyltransferasesと糖転移酵素を利用しています。 glycorandomizationのために容易に利用可能なUDP / dTDP糖のレパートリーを拡大するために、我々は今、サルモネラ菌LT2α-D-グルコピラノシルホスフェートthymidylyltransferase（E（pによって受け入れられるα-D-hexopyranosylリン酸の多様性を高めるための構造ベースのエンジニアリング·アプローチを報告する））。この資料では、このタイプのアプローチから、成功と予期しない結果の両方を示す、設計原理、決定基質特異性、3つの "設計された"変異の構造の解明を強調しています。さらに、基質結合ポケット（L89T）の単一のアミノ酸置換が大幅に含めるようにα-D-アロ、α-D-をE（p）で受け入れられるα-D-hexopyranosylリン酸塩のセットを増加することが分かったaltro-およびα-D-talopyranosylリン。集計では、我々の結果はin vitroでのglycorandomizationでの第一歩である設計によって、nucleotidylyltransferase特異性を変更するための貴重な青写真を提供しています。
膿ヒドロペルオキシド耐性タンパク質のOHRの構造と機能解析
細菌は、活性酸素種による被害を解毒し、修復する複雑な戦略を開発しました。病原性微生物に対する防御機構として宿主の免疫系細胞によって同様に細菌の好気的呼吸の間に生成これらの化合物は、核酸、タンパク質、リン脂質膜に損傷を与える能力を持っています。ここでは、緑膿菌OHR、有機ヒドロペルオキシド耐性タンパク質の最近発見された家族のメンバーの結晶構造を記述します。 OHRは、新規のα/β倍で、しっかりと折り畳まれたホモ二量体であり、分子の反対側の単量体の界面に位置する2つの活性部位を含んでいます。 in vitroアッセイを用いて、毒性の低い代謝物に無機と有機の両方のヒドロペルオキシドに変換し、直接ヒドロペルオキシド還元酵素としてそのOHRの機能を示しています。部位特異的突然変異誘発法は、アクティブな各サイト内の2つの保存されたシステインが触媒活性に必須であることを確認します。我々は直接ヒドロペルオキシドの減少を誘発するために反応性の高いシステインのチオール基を利用し、OHR触媒機構が構造的に無関係peroxiredoxinsの場合と同様であることを提案する。
NOVMの基質特異性：ノボビオシンの生合成とGlycorandomizationへのインプリケーション
[反応：テキストを参照してください]のin vitro glycorandomizationの天然物（IVG）の範囲を拡大するための取り組みの中で、NOVMの基質特異性を調べた。 4アグリコンアナログと40以上の糖ヌクレオチドのテストでは、NOVMは驚くほど厳しい基質特異性を持ち、3つだけ新しい "不自然な"自然な製品を提供した。決定基質特異性に基づいて、糖ヌクレオチド合成教義とIVGの一般的な適用のための注意書に代わるものを紹介しています。
Nogo-66受容体と関連するタンパク質の構造と軸索伸長阻害剤の結合
ミエリン由来のタンパク質は眼球運動、MAGとOMgpは、脊髄や脳の損傷後の軸索再生を制限します。マルチサブユニットを介してこれらの細胞表面タンパク質の信号は、共通のリガンド結合グリコシルホスファチジルイノシトールアンカー型サブユニットを含む神経細胞の受容体は、Nogo-66受容体（NGR）と呼ばれる。欠失解析により、我々は細胞表面のNGRに眼球運動を、MAGとNGRの可溶性フラグメントの結合は全体のロイシンリッチリピート（LRR）NGRの領域ではなく、タンパク質の他の部分が必要であることを示しています。 NGRとの広範な配列類似性を共有しているにもかかわらず、我々が同定した2関連タンパク質、NgR2とNgR3は、眼球運動、MAG、OMgpまたはNGRをバインドできません。 NGR特異性とマルチリガンドの結合を調べるために、我々は、NGRの生物学的に活性なリガンド結合可溶性細胞外ドメインの結晶構造を決定した。分子が伸長し、N末端キャップと小さなC末端ドメインに挟まれた8 LRRsから生じる曲率を持つ形のバナナです。 NGRの構造解析と同様に、NgR2とNgR3に保存されていないNGRの表面残基の比較では、機能的なシグナル伝達複合体のアセンブリ内の重要な潜在的なタンパク質相互作用部位を識別します。
セマフォリン-3A受容体結合モジュールの構造
セマフォリンは神経細胞の移動と軸索ガイダンスを含め、開発中のプロセスの様々に関与する細胞外タンパク質の大規模なグループである。彼らの特徴は、プレキシンと散乱因子受容体のリガンド - 受容体相互作用のモジュールも存在し、保存された500アミノ酸セマフォリンドメインです。我々は完全なセマフォリンドメインを含む、セマフォリン-3A（Sema3A）が分泌された65 kDaの形の結晶構造を報告します。不意に、セマフォ倍はベータプロペラトポロジのバリエーションです。 Sema3A構造と構造に基づく突然変異誘発データの分析では、ニューロピリン結合部位を特定し、潜在的なプレキシンの相互作用部位を示唆している。構造に基づいて、我々は、セマフォリンシグナル伝達の開始のためのモデルを提示し、そのようなインテグリンとLDL受容体などの他のβプロペラ細胞表面受容体のシグナル伝達機構、潜在的な類似性を議論する。
大腸菌ヒドロペルオキシド耐性タンパク質のOsmCの構造と機能の特徴
浸透圧誘導タンパク質OsmCは、その優れた特徴づけホモログ、有機ヒドロペルオキシドのタンパク質OHRのように、有機ヒドロペルオキシドへの暴露によって引き起こされる酸化ストレスに対する防御に関与している。 OsmCここで報告された大腸菌（Escherichia coli）の結晶構造は蛋白質がしっかりと折り畳まれた分子の反対側の単量体の界面に位置する2つの活性部位を持つ二量体ドメインがスワップであることがわかります。我々はOsmCが優先的に無機過酸化水素を介して有機ヒドロペルオキシドを代謝することを示している。構造と酵素の類似性に基づいて、我々はOsmC触媒機構は、OHRタンパク質の構造と無関係peroxiredoxinsのこと、直接ヒドロペルオキシドの減少を誘発するために反応性の高いシステインのチオール基を使用することに類似していることを提案する。
1-アザ-8-チアビシクロ[4.2.1]ノナ-2,4 - ジエン8,8 - ジオキシドと光誘起SO2-Nボンドの切断を経て、ひずみスピロ環への変換の合成
二重に不飽和のブリッジヘッドスルタム12へのルートが開発されました。 350nmで照射したとき、この共役ジエンは構造的に小説シクロブテンから構成されるスピロ環17、チエタン二酸化炭素、ピロリジン環に2光子過程を経由して異性化されています。 17の生成と選択反応の可能性のメカニズムは、その報告されています。 [反応：テキストを参照してください。]
クラスの識別を撃退：エフリン-A5はに結合し、EphB2受容体のシグナル伝達を有効にします
エペソ受容体チロシンキナーゼとそのエフリンリガンド間の相互作用は、細胞遊走と軸索の経路探索を調節する。 EphB受容体はエフリン-Bリガンドと相互作用するのに対し、EphA受容体は、一般的には、エフリンリガンドによって活性化になると考えられている。ここでは、互いに相互作用することが記載されていなかったEphB2及びエフリン-A5は、実際のバインド1に高い親和性を持つ別のもので最も広く、これらの分子の研究の二つを行うことを示している。エフリン-A5にEphB2発現細胞の曝露は、受容体のクラスター形成、自己リン酸化および下流のシグナル伝達の開始につながる。エフリン-A5は、モデルシステムのEphB2媒介成長円錐の崩壊と神経突起退縮を誘導する。我々はさらにエフリン-A5-EphB2複合体はヘテロ二量体であり、四量体EphB2-エフリン-B2構造からアーキテクチャ異なっていること、X線結晶学を用いて、表示されます。構造データは、EphB2-エフリン-A5シグナル伝達の分子基盤を明らかにし、A-およびBのサブクラスEph受容体とエフリンの間の機能的相互作用とクロストークの複雑さを理解するためのフレームワークを提供します。
Tie2の認識に関与する表面のアンジオポエチン-2受容体結合ドメインおよび識別の構造
アンジオポエチンは、哺乳動物の血管やリンパ系の成熟と維持に重要な役割を果たす分泌糖タンパク質の小クラスで構成されています。彼らは、チロシンキナーゼ受容体ファミリー、Tie2の部材を介してその効果を発揮する。高い相同性を、文脈依存的にアゴニストまたはアンタゴニストとして機能することができますがAngiopoietin/Tie2シグナリングは、その異なるアンジオポエチンリガンドのチロシンキナーゼ受容体 - リガンドシステム間で一意です。この分子の二分法を理解する努力で、我々は、結晶化および2.4のアンジオポエチン-2（Ang2）受容体結合領域の結晶構造を決定した。構造はユニークなC末端Pドメインと倍にフィブリノゲンを明らかにする。保全分析と構造ベースの突然変異誘発はAng2分子表面を仲介する受容体の認識の溝を識別します。
受容体認識とシグナル伝達のための含意：エフリン-B1細胞外ドメインの結晶構造
Eph受容体とそのエフリンリガンドは、軸索の神経系の経路探索と血管内皮細胞の細胞間相互作用を含む、開発中の細胞間コミュニケーションのさまざまな側面に関与している。最近の構造研究は、以前は他の受容体 - リガンドの家族では見られないユニークな分子機能を明らかにし、EPHSとエフリンの生化学的およびシグナリング特性の多くを説明した。しかし、未解決の質問は、これらの重要なシグナル伝達分子の潜在的なオリゴマー化とクラスタリングに関する残っています。本研究では、エフリン-B1の細胞外ドメインの生物物理学的特性と受容体結合設定が調べた、その結晶構造は、2.65の分解能で決定した。それは以前に密接にエフリン-B2フォームホモ二量体に関連することが示された一方エフリン-B1は、溶液中と結晶の両方のモノマーである。エフリン-B1とエフリン-B2間の主な構造上の違いは、受容体結合GHループとエフリン-B1の部分的に乱れたN末端四量体化領域のコンフォメーションです。 GHループは、エフリン-B2構造的に剛性であり、それが受容体に依存しないホモ二量体化を媒介する受容体結合および非結合リガンド、両方で同じコンフォメーションを採用しています。エフリン-B1構造で、一方、GHループは、任意の同型相互作用に関与し、新たに別個のコンフォメーションを採用していません。エフリン-B1構造の含意は、利用可能なエフリン-B1変異誘発データのコンテキストでは、エペソ-エフリンの認識とシグナル伝達の開始のメカニズムについて議論されています。
B-ベンジル-9-ボラビシクロのパラジウム触媒クロスカップリングには、[3.3.1]ノナンは、メチレン架橋ビアリールを提出する
[反応：テキストを参照してください] Benzylboranesは、鈴木 - 宮浦カップリング反応の中で目立っては珍しくパートナーです。 B-ベンジル-9-BBNが正常にヘテロ/アリール臭化物、塩化物の範囲に結合され、薬理学的に重要なメチレン架橋ビアリール構造を与えるためにトリフされました。 、活性化不活性化し、立体障害性基板が正常に触媒系としてSPhosでのPd（PPH（3））（4）またはPd（OAc）（2）を使用して高収率でカップリングさせた。
アダムはエペソに適合：ADAMの基質認識モジュールは、トランスのエフリン切断の分子スイッチとして機能
受容体チロシンキナーゼとそのエフリンリガンドのEphファミリーは、細胞間のコミュニケーションの媒介物質である。 ADAM10膜メタロプロテアーゼによってエフリン-A2の切断はエペソとエフリン-発現細胞との間の接触反発力を可能にします。 ADAM10は、切断する規制方法で、エフリンと対話する方法のみエペソバインドされたエフリン分子は不明である。 ADAM10インテグリンとシステインリッチドメインと機能的研究の構造はephrin-A5/EphA3複合体とADAM10の機能的相互作用のために必須の基質認識モジュールを定義するここで提示した。 EphA3とADAM10恒常的に関連付けながら、機能EphA3/ephrin-A5複合体の形成は、効果的なエフリン-A5切断用プロテアーゼドメインを配置ADAM10システインリッチドメインの新しい分子認識モチーフを作成します。驚くべきことに、切断はADAM10とその基板が反対細胞の膜上にあると、トランスで発生します。我々のデータは、エペソバインドされたエフリンが認識され切断されることが保証されADAM10媒介エフリンタンパク質分解を調節するための単純なメカニズムを示唆している。
Tie2受容体の細胞外ドメインおよびアンジオポエチン-2 - Tie2の複合体の結晶構造
タイ受容体チロシンキナーゼとそれらのアンジオポエチン（ANG）配位子は、発達および腫瘍血管新生の中心的な役割を果たしている。ここでは、単独およびAng2との複合体Tie2のリガンド結合領域の結晶構造を提示します。予測とは対照的に、Tie2のは、コンパクトで矢じり状の構造に3つの上皮成長因子ドメインと一緒に折りません2が、3つの免疫グロブリン（Ig）ドメインを含んでいます。 Ang2は、2つの相補的な面がないドメインの再構成のいずれかの分子の小さなコンフォメーション変化と相互に作用する受容体キナーゼのリガンド認識固有のロックおよびキーモードを利用した矢印の先端に結合します。 Ang2-Tie2の認識のIg倍以内のリガンド結合部位の位置を含む、抗体タンパク質の抗原認識に類似しています。構造と構造ベースの変異誘発の解析では、受容体活性化のメカニズムへの洞察を提供し、すべてのアンジオポエチンが構造的に同様の方法でTie2のやり取りという仮説を支持している。
哺乳動物細胞で産生された組換えタンパク質の高効率セレノメチオニン標識
多波長異常回折廃止法の出現が大幅に結晶構造決定を加速しており、蛋白質結晶学における規範となっています。このメソッドは、研究者が多様な原子からの異常信号を活用することができますが、誘導体製剤のための支配的な方法は、セレノメチオニン置換である。いくつかの一般的に適用可能な、高効率のラベリングプロトコルは、細菌、酵母、バキュロウイルス/昆虫細胞発現システムでの使用にはなく、哺乳類の組織培養のために開発されている。生物医学の重要性タンパク質の数が多いだけ哺乳動物発現系のX線回折実験のための十分な収率で製造することができるとして、そのようなプロトコルを開発するために、すべてのより重要になります。そこで、取り込みレベルを決定する役割を果たして、ここで定期的に収率> 90％の標識効率、哺乳動物細胞中のタンパク質のセレノメチオニン修正のための単純なプロトコルを報告するいくつかの変数を評価した。
ヨギによって舌ピアス：かかりやす観測
：本研究で、彼は自発的な痛みのコントロールを示している舌ピアス時のヨギから記録へのかかりやす観測を報告します。かかりやすはインピーダンスと成果物のための適切なコントロールを含む19サイトからLexicor 1620で記録した。神経科医は、異常のデータを読み取り、かかりやすは、マッピング、単一および複数のヘルツビン、コヒーレンス、規範的なデータベースとの統計的比較によって分析した。セッションでは、瞑想のベースラインと舌ピアスが含まれています。瞑想のベースライン期間中にヨギのかかりやすマップは、彼が休止状態に彼の脳活動を下げることができることが示唆された。この状態は、ピアスの間に徐波電位（デルタ）の優位性を示し、ヨギは、個人が鎮痛下にあるときに見られるものと似ているかもしれない状態を誘導することが示唆された。さらなる研究は、基礎となるメカニズムを決定するために自己規制の例外を示す個人のグループで実施されるべきであり、スキルが痛みを管理する方法を他人に教えるために使用することができかどうかを指定します。
Tie1-Tie2の相互作用は、アンギオポエチンのリガンド間の機能の違いを仲介する
内皮特異的受容体チロシンキナーゼのタイファミリーは、細胞の増殖、遊走、血管新生の間の生存にとって不可欠である。かなりの類似性にもかかわらず、Tie1またはTie2の欠損マウスを用いた実験は、生体内でこれらの受容体の異なる機能を強調表示します。 Tie2受容体は、構造的に相同配位子に関してさらにユニークです。アンジオポエチン-2および-3アゴニストまたはアンタゴニストとして機能することができます。アンジオポエチン-1、-4は、構成的アゴニストである。アンジオポエチン媒介Tie2のシグナル伝達におけるTie1の役割に対処し、個々のアンジオポエチンの動作のための基礎を決定するために、我々はTie1と-2の局在との関連付けを監視するためのFRETに基づく近接アッセイ、in vivoで使用されます。我々は、細胞表面上のTie1-Tie2の複合体形成の証拠を提供し、受容体 - 受容体認識のための必須の分子表面領域を識別します。我々はさらにTie1-Tie2の相互作用は、動的な抑制、およびアンジオポエチン-1および-2により差動変調であることを示している。利用可能なデータに基づいて、我々は、アンジオポエチン誘発性Tie2のシグナルのための統一モデルを提案する。
哺乳動物細胞からの組換えヒトAutotaxin /リゾホスホリパーゼDの大規模な精製とキャラクタリゼーション
我々はautotaxin（ATX）/リゾホスホリパーゼD、リゾホスファチジン酸の合成に関与する血液中の酵素が存在を浄化し、特徴付けるために、哺乳動物発現系を利用しました。人間のATXをコードするcDNAのアミノ酸29から915はCD5の分泌シグナルの下流にクローニングした。カルボキシル末端のタンパク質の精製を容易にするために、IgGの定常領域（Fc）のに続いてトロンビン切断部位であった。 ATX-Fc融合タンパク質は、HEK293細胞で発現させ、蛋白質トロンビンで切断し、続いてセファロースによるアフィニティークロマトグラフィーによる安定したクローンの馴化培地から単離された。タグなしATXタンパク質は、さらに約5 mg / Lの培地の収率でゲルろ過クロマトグラフィーにより本質的な均質性に精製した。精製したATXタンパク質は、この重要な酵素のさらなる生物学的および構造的研究のための便利なツールを提供し、酵素活性および生物学的機能であった。
