Summary
وأظهرت عملية جراحية لتحريض نقص التروية hindlimb من جانب واحد ، مع التأكيد على نقص التروية التصوير بواسطة الليزر دوبلر الارواء.
Abstract
في الولايات المتحدة ، والشرايين الطرفية المرض (PAD) يصيب نحو 10 مليون شخص ، وأيضا في جميع أنحاء العالم انتشارا. وتقتصر علاجات طبية لتخفيف الأعراض. التدخلات الجراحية أو اللف مفيدة لبعض الأفراد ، ولكن على المدى الطويل وغالبا ما تكون النتائج مخيبة للآمال. نتيجة لذلك ، هناك حاجة لتطوير علاجات جديدة لعلاج PAD. ونقص التروية hindlimb الفئران إعداد نموذج للPAD ، ومفيد لاختبار علاجات جديدة. بالمقارنة مع نماذج أخرى من نقص تروية الأنسجة مثل ربط الشريان التاجي أو الدماغية ، ربط الشريان الفخذي ينص على أبسط نموذج من الأنسجة الدماغية. المزايا الأخرى لهذا النموذج هي سهولة الوصول إلى شريان الفخذ وانخفاض معدل الوفيات.
في هذا الفيديو ، ونحن لشرح منهجية لهذا النموذج من الفئران الإسكيمية hindimb من جانب واحد. وسيتم وصف المواد وإجراءات محددة لإنشاء وتقييم هذا النموذج ، بما في ذلك تقييم التروية أطرافهم بواسطة الليزر دوبلر التصوير. ويمكن أيضا أن تستخدم هذا البروتوكول لزرع وتتبع غير الغازية من الخلايا ، وهو ما يتضح من هوانغ وآخرون 1.
Protocol
1. تحريض نقص التروية Hindlimb الانفرادية
- الأدوات الجراحية اللازمة لهذه العملية ما يلي : ملقط وأشار غرامة ، وأشار ملقط ، مقص الربيع ، مقص جراحي ، حامل الإبرة ، وضام. مبعاد نجعل منطقتنا باستخدام مشبك لأنه أصغر من الكامشات متاحة تجاريا. تعقيم هذه الأدوات قبل الجراحة عن طريق الأوتوكلاف معقم أو الساخنة حبة. وسيتم أيضا أداة الكي ومعقمة غرامة مسحات القطن وأوضح أن هناك حاجة لهذه الجراحة. فمن المستحسن أن تكون أدوات إعادة تعقيمها في النصائح حسب الحاجة أثناء العملية.
- عندما الأدوات جاهزة ، ضع الماوس في غرفة التخدير التي تحتوي على تحريض 1-3 ٪ isoflurane في الأكسجين 100 ٪ في معدل تدفق 1L/min.
- ترك الماوس في غرفة تحريض حتى لا يستجيب للمؤثرات الخارجية. ثم إزالة الحيوان من غرفة التعريفي. ينصح بمسح مخدر من مربع قبل فتح الغطاء ، لتقليل التعرض لisoflurane المشغل.
- ثم ضع الحيوانات في موقف ضعيف على الطاولة ما قبل التشغيل وتوصيله إلى التدفق المستمر للisoflurane. استخدام ماكينة حلاقة كهربائية ، وإزالة الشعر من hindlimb. تطبيق كريم إزالة الشعر لإزالة الشعر تماما.
- ضع الماوس في موقف ضعيف على وسادة ساخنة رايات على طاولة العمليات ، وتوصيله إلى التدفق المستمر للisoflurane. توسيع وتأمين hindlimb مع قطعة من الشريط. مرة واحدة في hindlimb آمن ، مسح الجلد مع ثلاثة betadine الدعك والكحول بالتناوب. للفترة المتبقية من العملية الجراحية ، واستخدام المجهر في تشريح 10X 20X أو التكبير للحصول على موسع للرأي في المنطقة hindlimb.
- باستخدام ملقط ومقص الجراحية الدقيقة ، وجعل شق الجلد ، وحوالي 1 سم طويلة ، من الركبة باتجاه الفخذ الإنسية.
- استخدام الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) رطب غرامة مسحات القطن وأشار ، بلطف فرشاة بعيدا الأنسجة الدهنية تحت الجلد المحيطة عضلة الفخذ.
- المقبل ، تطبيق مستعرض للمكواة شق طريق تشريح والنسيج تحت الجلد من الدهون لكشف الشريان الأساسي الفخذ.
- استخدام مبعاد لفتح الجرح والحصول على عرض أفضل من الأوعية الدموية السفلى.
- باستخدام الملقط وغرامة غرامة مسحة القطن وأشار ، من خلال اختراق الغلاف بلطف على الفخذ الغشائي لفضح حزمة وعائية عصبية.
- ثم ، باستخدام مجموعة نظيف ملقط الجميلة ومسحة القطن ، وتشريح وفصل الشريان الفخذي من الوريد الفخذي والعصب في الموقع القريب قرب الفخذ. بعد التشريح ، وتمرير خيط الحرير من الدرز تحت 7-0 نهاية القريبة من شريان الفخذ. انسداد الشريان الفخذي القريبة باستخدام عقدة مزدوجة. وضع ربطة عنق على متن السفينة والداني في الجرح ممكن من أجل ترك طول لادراك التعادل الثاني وقطعة التدخل التي سيتم مقطوع.
- فصل الشريان الفخذي من الوريد الفخذي في الموقع البعيدة القريبة من الركبة. تمر بنوع من 7-0 الدرز تحت الغاية البعيدة من شريان الفخذ الأقرب إلى الشريان المأبضي. تسد به السفينة عقدة مزدوجة.
- انسداد الشريان الفخذي القاصي مع مجموعة ثانية من عقدة مزدوجة القريبة فقط لأول مجموعة من عقدة. وسوف تستخدم هذه المجموعة الثانية من الغرز لتجتاح الشريان أثناء إجراء المعاملات.
- وبالمثل ، لأغراض تجتاح ، انسداد الشريان الفخذي القريب مع مجموعة ثانية من عقدة مزدوجة القاصي عادل لأول مجموعة من عقدة.
- المسح الشامل لجزء من شريان الفخذ بين القاصي والداني عقدة مع مسحة القطن الناعم وأشار مقصا الربيع. توخي الحذر بعدم اختراق جدار الوريد الفخذي.
- إزالة مبعاد وأغلق الجرح باستخدام خيوط Vicryl 5-0. هذه الخيوط لا تحتاج إلى إزالتها في وقت لاحق ، كما أنها تذوب من تلقاء نفسها.
- بمجرد أن يتم إغلاق الجرح ، ضع الحيوان على قمة منصة ساخنة ملفوفة في قفص الانتعاش ورصد مستمر حتى يستيقظ.
- بعد تعافى الحيوان لمدة 1 ساعة ، والمضي قدما في خطوة دوبلر الليزر نضح الدم من أجل تأكيد تحريض نقص التروية.
2. الليزر دوبلر الإرواء الدم
- لبدء نضح دوبلر الليزر خطوة ، ضع الماوس في غرفة التخدير التي تحتوي على تحريض 1-3 ٪ isoflurane في الأكسجين 100 ٪ في معدل تدفق 1L/min.
- ترك الماوس في غرفة تحريض حتى لا يستجيب للمؤثرات الخارجية. ثم إزالة الحيوان من غرفة التعريفي. ينصح بمسح مخدر من مربع قبل فتح الغطاء ، لتقليل التعرض لisoflurane المشغل.
- وضع الحيوانات على الطاولة ما قبل التشغيل متصلة التدفق المستمر للisoflurane. ثم إزالة الشعر من hindlimb باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية يليه كريم إزالة الشعر عند الضرورة.
- بعد إزالة الشعر ،وضع الحيوان على سطح ساخن 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في إطار استمرار تدفق isoflurane. رصد درجة الحرارة الأساسية لضمان euthermia ، والتغيرات في درجات الحرارة سيؤثر بشكل ملحوظ الارواء.
- بعد 5 دقائق ، ضع الحيوان في موقف ضعيف على سطح امتصاص الضوء غير عاكسة مثل قماش خضراء اللون ، وصلة إلى التدفق المستمر للisoflurane. تمديد hindlimbs.
- المقبل ، بدوره على تصوير دوبلر الليزر وبرنامج اقتناء وتهيئة البرنامج. تحديد حجم ومجال الرؤية والقرار. فمن الأفضل للحفاظ على مجال الرؤية وكثافة بكسل متناسقة بين الحيوانات من أجل جعل تحليل أسهل في المستقبل.
- فتح ملف جديد. اضغط على بدء ستبدأ بالحصول على بيانات الصورة. عموما ، فإن تصوير تلقائيا بالكشف عن المسافة من الفأرة ، ولكن إذا طلب منك ، حدد المسافة من الحيوان للتصوير. وسوف تظهر ليزر حدود مجال الرؤية وتبدأ بعد ذلك الحصول على البيانات.
- بعد الاستحواذ الكامل ، وسوف نبدأ في صورة تظهر مجموعة من الألوان التي تدل على مستوى التروية الدموية في الساقين. يمكن تعيين الألوان إلى طائفة معينة نضح لمقارنة البيانات بين أفضل الحيوانات.
- عند الحصول على البيانات غير كاملة ، وحفظ الملف.
- ثم يعود للحيوان في قفص الانتعاش ورصد مستمر حتى الحيوان مستيقظا.
- لتحليل البيانات ، واستخدام عتبة التكيف في البرنامج التحليل لطرح أي ضجيج في الخلفية. A عتبة 0.2 عادة قيمة معقولة. 2 حدد المناطق المصالح ، أو رويس ، التي تغطي كل منطقة hindlimb. ويمكن استخدام مجموعة متنوعة من معالم لتوحيد ROI بين أطرافه والحيوانات. ثم تحديد التروية يعني وتقلب في عائدات الاستثمار. ويمكن بعد ذلك الفرق نضح ونسبة التروية الدماغية بين الأطراف والأطراف السيطرة تحدد بسهولة.
- ويمكن تكرار هذا الإجراء لمتابعة التغيرات في نضح hindlimb مع مرور الوقت. في نقطة الوقت المطلوب ، يمكن أن يتم التخلص من الحيوانات لتقييم وظيفة الأنسجة وبالمقارنة مع بيانات الصور الارواء.
3. ممثل النتائج :
يظهر تشريح الأوعية الدموية hindlimb في الشكل 1 2. ويظهر رسم بياني ممثل hindlimb بعد explantation شريان الفخذ في الشكل 2. لتأكيد تحريض نقص التروية لhindlimb والليزر صورة نضح دوبلر تحليل يدل على انخفاض كبير في تدفق الدم إلى الأطراف الدماغية ، مقارنة أطرافهم السيطرة ، كما هو مبين في الشكل 3.
الشكل 1. تشريح الأوعية الدموية hindlimb. النجمية تشير إلى مواقع ربط لاستحثاث الإسكيمية hindlimb.
الشكل 2. رسم تخطيطي يظهر الممثل تشريح hindlimb بعد ربط الشريان الفخذي في المواقع القريبة والبعيدة بعد ازالة شريان الفخذ.
الشكل 3. الليزر دوبلر الصور تبين تدفق الدم قبل وبعد تحريض نقص التروية لhindlimb اليسار (المشار إليها بواسطة السهم).
Discussion
هناك بعض المصادر لتقلب للنظر في حين تخطيط وتنفيذ نماذج hindlimb نقص التروية. أولا ، قد يكون مستوى الإسكيمية تختلف وفقا لموقع ربط فيما يتعلق بذلك من الفروع الجانبية. لذلك ، لاتساق النموذج ، ينبغي أن تخضع هذه الحيوانات على نفس المستوى من ربط الشرايين. ويرتبط مصدر آخر للتقلبات في الانتعاش الدماغية إلى سن هذه الحيوانات ، مع صغار الحيوانات (6-8 أسابيع من العمر) وجود معدلات الاسترداد بشكل أسرع وأكثر اكتمالا من أقدم الحيوانات (8-10 شهرا) ، وفقا لتقييم الدورة الدموية (أي الليزر دوبلر التروية) أو وظيفية (أي اختبار مفرغه) التدابير. للدراسات في واحد الذي هو تقييم وكيلا عائية ، فإنه قد يكون من الأفضل استخدام الحيوانات الأكبر سنا ، لأنه قد يكون لاحظ الفرق بين أكبر المجموعات التي لها التدخل العلاجي. على العكس ، للدراسات في واحد الذي هو عامل تقييم المضادة للعائية ، فإنه قد يكون من الأفضل استخدام الحيوانات الأصغر سنا لتعظيم تأثير حجم 3.
إذا أجريت بشكل صحيح ، يجب أن يكون هناك الحد الأدنى من مضاعفات مثل النزيف ، العدوى ، أو وفيات. إذا كان النزيف يحدث عن اضطراب عرضية من الوريد الفخذي أو غيرها من السفن ، وضغط معتدل مع قطعة من القطن المعقم يميل يجب تطبيقها قضيب أو الشاش لموقع نزف حتى يتوقف النزيف. ينبغي معاملة الحيوانات التي تظهر عليها علامات العدوى مع وكلاء المضادة للعدوى. قد الحيوانات العارضة الغرغرينا كبيرة تحتاج إلى beeuthanized. هذا التعقيد هو أكثر شيوعا في كبار السن الحيوانات ، وكذلك في بعض السلالات ، مثل الفئران BALB ج 4 بالإضافة إلى ذلك ، قد يكون النموذج الإسكيمية hindlimb تسبب الألم الخفيف إلى المعتدل. لذا ، ينبغي أن تدار مثل المسكنات أو البوبرينورفين كاربروفين حسب الحاجة لعلاج الألم ، وفقا لتوصيات IACUC.
في الختام ، لقد أثبتنا طريقة بسيطة وقابلة للتكرار لدراسة PAD في نموذج الفئران من نقص التروية hindlimb. نموذج الإسكيمية hindlimb مع تحليل ليزر التصوير دوبلر هو نظام ممتاز لدراسة أمراض الأوعية الدموية لتقييم المرشحين والعلاجية.
Acknowledgments
المؤلفان بالشكر اندريا Axtell ، إيتوه ساتوشي ، MD ، Velotta جيف ، MD ، هويت غرانت ، روبرت روبنز C. ، MD ، يو جين ، MD ، تيم دويل ، دكتوراه ، والتصوير ستانفورد الحيوانات الصغيرة الأساسية للحصول على المساعدة التقنية. الكتاب أيضا أن أشكر AM بيكفورد ، وشركة للحصول على الدعم من المعدات البيطرية. وأيد هذا البحث عن طريق المنح البحثية من المعاهد الوطنية للصحة (R01 HL - 75774 ، CA098303 R01 ، R21 HL085743 ، 1K12 HL087746) ، والتبغ كاليفورنيا بحوث أمراض ذات صلة برنامج من جامعة كاليفورنيا (15IT - 0257 و1514RT 0169) ، ومعهد كاليفورنيا للطب التجديدي (RS1 - 00183). معتمد من قبل NH الزمالة من جمعية القلب الاميركية.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Tools | Tool | Fine Science Tools | ||
| Constix Cotton Swabs | Tool | Contec | SC-4 | |
| Betadine (Povidone-iodine) | Reagent | PDI | ||
| 70% alcohol | Reagent | Kendall | ||
| Phosphate Buffered Saline | Reagent | Invitrogen | ||
| 7-0 silk suture | Tool | Genzyme | ||
| 5-0 vicryl suture | Tool | Ethicon Inc. | ||
| Electric shaver | Tool | GE Healthcare | ||
| Cautery | Tool | Baxter Internationl Inc. | ||
| Laser Doppler and PeriScan PIM 3 System | Equipment | Perimed |
References
- Huang, N. F., Niiyama, H., De, A., Cooke, J. P., , Transplantation and non-invasive tracking of embryonic stem cell-derived endothelial cells for treatment of hindlimb ischemia. J Vis Exp. , (2008).
- Cook, M. J. The anatomy of the laboratory mouse. , Academic Press. New York. (1976).
- Niiyama, H., Kai, H., Yamamoto, T., Shimada, T., Sasaki, K., Murohara, T., Egashira, K., Imaizumi, T. Roles of endogenous monocyte chemoattractant protein-1 in ischemia-induced neovascularization. J. Am. Coll. Cardiol. 44, 661-666 (2004).
- Dokun, A. O., Keum, S., Hazarika, S., Li, Y., Lamonte, G. M., Wheeler, F., Marchuk, D. A., Annex, B. H. A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia. Circulation. 117, 1207-1215 (2008).
