Summary
La procédure chirurgicale pour l'induction d'une ischémie unilatérale des membres postérieurs est démontré, avec confirmation d'ischémie par imagerie laser Doppler perfusion.
Abstract
Aux États-Unis, la maladie artérielle périphérique (MAP) affecte environ 10 millions d'individus, et est aussi dans le monde entier répandue. Les thérapies médicales pour le soulagement symptomatique sont limitées. Les interventions chirurgicales ou endovasculaires sont utiles pour certaines personnes, mais à long terme les résultats sont souvent décevants. En conséquence, il est nécessaire de développer de nouvelles thérapies pour traiter la MAP. La préparation des membres postérieurs murin d'ischémie est un modèle de la PAD, et est utile pour tester de nouvelles thérapies. Lorsqu'on les compare à d'autres modèles d'ischémie tissulaire comme la ligature des artères coronaires ou cérébrales, la ligature artère fémorale prévoit un modèle plus simple des tissus ischémiques. D'autres avantages de ce modèle sont la facilité d'accès à l'artère fémorale et faible taux de mortalité.
Dans cette vidéo, nous démontrons la méthodologie utilisée pour le modèle murin d'ischémie hindimb unilatérale. Les matériaux et les procédures spécifiques pour la création et l'évaluation du modèle seront décrites, y compris l'évaluation de la perfusion de membre par laser Doppler. Ce protocole peut également être utilisé pour la transplantation et le suivi non invasif des cellules, ce qui est démontré par Huang et al. 1.
Protocol
1. Induction de l'ischémie des membres postérieurs unilatérale
- Les instruments chirurgicaux nécessaires pour cette opération comprennent: amende pince pointue, une pince pointue, des ciseaux à ressort, ciseaux chirurgicaux, porte-aiguilles, et enrouleur. Nous fabriquons nos propres écarteur à l'aide d'un trombone, car elle est plus petite que enrouleurs disponibles commercialement. Stériliser ces outils avant la chirurgie par un autoclave ou un stérilisateur à chaud perle. Un outil de cautérisation et stérile beaux cotons-tiges souligné seront également nécessaires pour cette opération. Il est recommandé que les outils être re-stérilisés à l'extrémité que nécessaire durant la procédure.
- Lorsque les outils sont prêts, placez la souris dans la chambre de l'induction anesthésique contenant 1-3% d'isoflurane dans 100% d'oxygène à un débit d'1l/min.
- Laisser la souris dans la chambre de l'induction jusqu'à ce qu'il soit insensible aux stimuli extérieurs. Puis enlever l'animal de la chambre de l'induction. Il est recommandé de rincer l'anesthésie de la boîte avant d'ouvrir le couvercle, pour diminuer l'exposition des opérateurs à l'isoflurane.
- Ensuite, placez l'animal en décubitus dorsal sur la table de pré-exploitation et le connecter à un flux continu de l'isoflurane. Utiliser un rasoir électrique, enlever les poils de la patte postérieure. Appliquez la crème d'épilation pour bien enlever les poils.
- Placez la souris dans la position couchée sur un coussin drapé chauffée sur la table d'opération, et le connecter à un flux continu de l'isoflurane. Etendre et sécuriser les membres postérieurs avec un morceau de ruban adhésif. Une fois que le membre postérieur est sécurisé, essuyer la peau avec trois gommages bétadine et de l'alcool en alternance. Pour le reste de la procédure chirurgicale, l'utilisation d'un microscope de dissection à un grossissement de 10x ou 20x pour obtenir une vue agrandie de la région des membres postérieurs.
- En utilisant des pinces fines et les ciseaux chirurgicaux, faire une incision de la peau, d'environ 1 cm de long, à partir du genou vers la cuisse médial.
- En utilisant un tampon phosphate salin (PBS)-humidifié beaux cotons-tiges pointues, enlevez doucement la voie sous-cutanée des tissus adipeux entourant le muscle de la cuisse.
- Ensuite, appliquer le cautère transversalement pour inciser et disséquer à travers les tissus sous-cutanés graisses pour révéler l'artère fémorale sous-jacente.
- Utiliser un écarteur d'ouvrir la plaie et d'obtenir une meilleure vue de la vascularisation des membres inférieurs.
- En utilisant une pince fine et un coton-tige à pointe fine, délicatement percer la gaine membraneuse fémorale pour exposer le paquet vasculo-nerveux.
- Puis, en utilisant un ensemble propre de pinces fines et d'un coton-tige, disséquer et séparer l'artère fémorale de la veine fémorale et du nerf à l'endroit proximale près de l'aine. Après la dissection, passer un brin de 7-0 suture de soie au-dessous de l'extrémité proximale de l'artère fémorale. Occlusion de l'artère fémorale à l'aide de doubles noeuds. Placez le lien sur le navire comme proximale dans la plaie que possible afin de laisser la longueur pour le deuxième lien et un segment intermédiaire qui sera sectionné.
- Séparée de l'artère fémorale de la veine fémorale à l'endroit distale près du genou. Passez un brin de suture au-dessous de 7-0 de l'extrémité distale de l'artère fémorale proximale de l'artère poplitée. Occlure le vaisseau à l'aide de doubles noeuds.
- Occlusion de l'artère fémorale avec une deuxième série de doubles noeuds juste en amont de la première série de noeuds. Cette deuxième série de points de suture seront utilisés pour la préhension de l'artère pendant la procédure de transaction.
- De même, à des fins de préhension, une occlusion de l'artère fémorale avec une deuxième série de doubles noeuds juste en aval de la première série de noeuds.
- Transect le segment de l'artère fémorale entre les noeuds distale et proximale avec un coton tige fine et a une paire de ciseaux à ressort. Soyez prudent de ne pas percer la paroi de la veine fémorale.
- Retirer l'écarteur et fermer l'incision à l'aide des sutures Vicryl 5-0. Ces sutures n'ont pas besoin d'être retiré à un moment plus tard, comme ils se dissolvent.
- Une fois l'incision est fermée, placer l'animal sur le dessus d'un coussin chauffant drapé dans la cage de récupération et de surveiller en continu jusqu'à éveillé.
- Après animal a récupéré pendant 1 heure, passez à l'étape laser Doppler perfusion sanguine afin de confirmer l'induction d'ischémie.
2. Perfusion Laser Doppler sanguin
- Pour commencer l'étape par laser Doppler perfusion, placez la souris dans la chambre de l'induction anesthésique contenant 1-3% d'isoflurane dans 100% d'oxygène à un débit d'1l/min.
- Laisser la souris dans la chambre de l'induction jusqu'à ce qu'il soit insensible aux stimuli extérieurs. Puis enlever l'animal de la chambre de l'induction. Il est recommandé de rincer l'anesthésie de la boîte avant d'ouvrir le couvercle, pour diminuer l'exposition des opérateurs à l'isoflurane.
- Placez l'animal sur la table de pré-exploitation liés à l'écoulement continu de l'isoflurane. Puis enlever les poils de la patte arrière en utilisant un rasoir électrique suivi par la crème d'épilation, si nécessaire.
- Après avoir enlevé les cheveux,placer l'animal sur une surface de 37 ° C chauffée pendant 5 minutes sous flux continu de l'isoflurane. Surveiller la température du noyau afin d'assurer euthermia, comme les changements de température sera nettement affecter la perfusion.
- Après 5 minutes, placer l'animal dans la position couchée sur un non-réfléchissant absorbant la lumière de surface comme un chiffon de couleur verte, reliées à un flux continu de l'isoflurane. Étendre les membres postérieurs.
- Ensuite, tournez sur l'imageur laser à effet Doppler et le logiciel d'acquisition et d'initialiser le logiciel. Indiquez la taille du champ de vue et la résolution. Il est préférable de garder le champ de vision et de la densité de pixels cohérents entre les animaux afin de faire une analyse ultérieure plus facile.
- Ouvrez un nouveau fichier. Appuyez sur start pour commencer à acquérir les données d'image. Généralement, l'imageur détecte automatiquement la distance de la souris, mais si vous êtes invité, spécifiez la distance de l'animal à l'imageur. Le laser va montrer les frontières du champ de vue et ensuite commencer à acquérir des données.
- Après l'acquisition est terminée, l'image va commencer à montrer une gamme de couleurs qui sont une indication du niveau de la perfusion sanguine dans les jambes. Les couleurs peuvent être réglés à une gamme de perfusion spécifiques afin de mieux comparer les données entre les animaux.
- Lorsque l'acquisition de données est terminée, enregistrez le fichier.
- Puis retour à l'animal de la cage de récupération et de surveiller l'animal continue jusqu'à éveillé.
- Pour analyser les données, utilisez le réglage de seuil dans le logiciel d'analyse de soustraire le bruit de fond. Un seuil de 0,2 est généralement une valeur raisonnable. Sélectionnez deux régions d'intérêt, ou ROI, qui couvrent chaque zone membre postérieur. Une variété de points de repère peuvent être utilisés pour normaliser le ROI entre les membres et les animaux. Puis déterminer la perfusion moyenne et la variabilité dans le retour sur investissement. La différence de perfusion et le ratio entre la perfusion ischémique des membres et des membres de commande peut alors être facilement déterminée.
- Cette procédure peut être répétée pour suivre l'évolution de la perfusion des membres postérieurs au fil du temps. A un point de temps désiré, l'animal peut être euthanasiés pour l'évaluation de la fonction des tissus et la comparaison aux données de l'image de perfusion.
3. Les résultats représentatifs:
L'anatomie de la vascularisation des membres postérieurs est montré dans la figure 1 2. Un diagramme représentant du membre postérieur après explantation artère fémorale est montré dans la figure 2. Pour confirmer l'induction d'une ischémie de la patte postérieure, le laser Doppler d'analyse d'images de perfusion démontre une réduction spectaculaire de la circulation sanguine dans le membre ischémique, par rapport à la branche de contrôle, comme le montre la figure 3.
Figure 1. Anatomie de la vascularisation des membres postérieurs. Les astérisques indiquent les endroits de la ligature de l'induction d'une ischémie des membres postérieurs.
Figure 2. Schéma représentant montrant l'anatomie du membre postérieur après la ligature de l'artère fémorale au niveau des sites proximales et distales après le retrait de l'artère fémorale.
Figure 3. Laser Doppler montrant des images du flux sanguin avant et après l'induction d'une ischémie de la patte postérieure gauche (indiqué par la flèche).
Discussion
Il ya quelques sources de variabilité à considérer lors de la planification et l'exécution des modèles d'ischémie des membres postérieurs. Premièrement, le niveau de l'ischémie peuvent varier selon l'emplacement de la ligature par rapport à celle des branches latérales. Par conséquent, pour la cohérence du modèle, les animaux doivent subir le même niveau de la ligature des artères. Une autre source de variabilité dans la récupération ischémique est lié à l'âge des animaux, avec des animaux jeunes (6-8 semaines) ayant les taux de récupération plus rapide et plus complète que celle des animaux plus âgés (8-10 mois), tel qu'évalué par hémodynamique (ie laser Doppler perfusion) ou fonctionnelle (test sur tapis roulant par exemple) des mesures. Pour les études dans lesquelles on est d'évaluer un agent angiogénique, il peut être préférable d'utiliser des animaux plus âgés, car une plus grande différence entre les groupes peut être observé avec une intervention thérapeutique. Inversement, pour des études dans lesquelles on est d'évaluer un facteur anti-angiogénique, il peut être préférable d'utiliser des animaux plus jeunes afin de maximiser la taille 3 effet.
Si exécuté correctement, il devrait y avoir un minimum de complications comme le saignement, une infection ou de mortalité. En cas de saignement par la rupture accidentelle de la veine fémorale ou autres navires, une pression modérée avec un coton-tige stérile, ou de la gaze doit être appliquée sur le site de l'hémorragie jusqu'à ce que le saignement cesse. Les animaux présentant des signes d'infection doit être traitée avec des anti-infectieux. Animaux présentant une gangrène significative peut être nécessaire de beeuthanized. Cette complication est plus fréquente chez les animaux plus âgés, et dans certaines souches, comme BALB c souris 4. En outre, le modèle d'ischémie des membres postérieurs peuvent provoquer des douleurs légères à modérées. Par conséquent, les analgésiques tels que la buprénorphine ou carprofène doit être administré au besoin pour le traitement de la douleur, conformément aux recommandations de l'IACUC.
En conclusion, nous avons démontré une méthode simple et reproductible pour étudier PAD dans un modèle murin d'ischémie des membres postérieurs. Le modèle d'ischémie des membres postérieurs avec le laser Doppler analyse est un excellent système pour étudier les pathologies vasculaires et d'évaluation des candidats thérapeutiques.
Acknowledgments
Les auteurs remercient Andrea Axtell, Satoshi Itoh, MD, Jeff Velotta, MD, Grant Hoyt, Robert C. Robbins, MD, Jin Yu, MD, Tim Doyle, PhD, et le Stanford petit noyau d'imagerie animale pour l'assistance technique. Les auteurs remercient également AM Bickford, Inc pour le soutien des équipements vétérinaires. Cette recherche a été financée par des subventions de recherche du National Institutes of Health (R01 HL-75 774, R01 CA098303, R21 HL085743, 1K12 HL087746), le tabac en Californie Programme connexes Disease Research de l'Université de Californie (15IT-0257 et 1514RT-0169) , et le California Institute for Regenerative Medicine (RS1-00183). NH est soutenu par une bourse de l'American Heart Association.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Tools | Tool | Fine Science Tools | ||
| Constix Cotton Swabs | Tool | Contec | SC-4 | |
| Betadine (Povidone-iodine) | Reagent | PDI | ||
| 70% alcohol | Reagent | Kendall | ||
| Phosphate Buffered Saline | Reagent | Invitrogen | ||
| 7-0 silk suture | Tool | Genzyme | ||
| 5-0 vicryl suture | Tool | Ethicon Inc. | ||
| Electric shaver | Tool | GE Healthcare | ||
| Cautery | Tool | Baxter Internationl Inc. | ||
| Laser Doppler and PeriScan PIM 3 System | Equipment | Perimed |
References
- Huang, N. F., Niiyama, H., De, A., Cooke, J. P., , Transplantation and non-invasive tracking of embryonic stem cell-derived endothelial cells for treatment of hindlimb ischemia. J Vis Exp. , (2008).
- Cook, M. J. The anatomy of the laboratory mouse. , Academic Press. New York. (1976).
- Niiyama, H., Kai, H., Yamamoto, T., Shimada, T., Sasaki, K., Murohara, T., Egashira, K., Imaizumi, T. Roles of endogenous monocyte chemoattractant protein-1 in ischemia-induced neovascularization. J. Am. Coll. Cardiol. 44, 661-666 (2004).
- Dokun, A. O., Keum, S., Hazarika, S., Li, Y., Lamonte, G. M., Wheeler, F., Marchuk, D. A., Annex, B. H. A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia. Circulation. 117, 1207-1215 (2008).
