Summary
Das chirurgische Verfahren zur Induktion einer einseitigen Hinterlauf Ischämie nachgewiesen wird, mit der Bestätigung der Ischämie durch Laser-Doppler-Perfusion.
Abstract
In den Vereinigten Staaten betrifft periphere arterielle Verschlusskrankheit (pAVK) etwa 10 Millionen Menschen und ist auch weltweit verbreitet. Medizinische Therapien für symptomatische Linderung sind begrenzt. Chirurgische oder endovaskuläre Interventionen sind für einige Einzelpersonen nützlich, aber die langfristigen Ergebnisse sind oft enttäuschend. Als Ergebnis gibt es einen Bedarf für die Entwicklung neuer Therapien zur Behandlung von PAD. Die murine Hinterlauf Ischämie Vorbereitung ist ein Modell der PAD, und ist nützlich für die Erprobung neuer Therapien. Im Vergleich zu anderen Modellen der Gewebeischämie wie koronare oder zerebrale Arterienligation Vergleich bietet Femoralarterie Ligation für ein einfacheres Modell von ischämischem Gewebe. Weitere Vorteile dieses Modells sind die Leichtigkeit des Zugangs zu den Femoralarterie und niedrige Sterberate.
In diesem Video zeigen wir die Methodik für die murine Modell der einseitigen hindimb Ischämie. Die spezifischen Materialien und Verfahren für die Erstellung und Auswertung des Modells beschrieben werden, einschließlich der Beurteilung der Extremitäten-Perfusion mittels Laser-Doppler-Bildgebung. Dieses Protokoll kann auch für die Transplantation und nicht-invasive Tracking von Zellen, die von Huang et al demonstriert. 1 genutzt werden.
Protocol
1. Induktion von Einseitige Hinterlauf Ischämie
- Die chirurgische Instrumente für diese Operation erforderlich sind: feine spitzen Pinzette, spitzen Pinzette, Schere Frühjahr, chirurgische Scheren, Nadelhalter und Haken. Wir machen unsere eigene Retraktor mit einer Büroklammer, da es kleiner als handelsübliche Haken ist. Sterilisieren diese Tools vor der Operation durch ein Autoklav oder ein Hot-Bead-Sterilisator. Ein Kauter Werkzeug und sterile feinen spitzen Wattestäbchen wird auch für diese Operation erforderlich sein. Es wird empfohlen, dass die Werkzeuge an den Spitzen als während des Verfahrens benötigt erneut sterilisiert werden.
- Wenn die Werkzeuge bereit sind, platzieren Sie den Mauszeiger in die Narkose Kammer mit 1-3% Isofluran in 100% Sauerstoff bei einer Durchflussrate von 1l/min.
- Lassen Sie die Maus in die Induktion Kammer, bis es reagiert auf äußere Reize ist. Dann entfernen Sie das Tier von der Induktion Kammer. Es wird empfohlen, das Narkosemittel aus dem Karton vor bündig mit der Deckelöffnung, zur Verringerung der Exposition zu Isofluran zu verringern.
- Dann legen Sie das Tier in Rückenlage auf den pre-OP-Tisch und verbinden Sie es mit einem kontinuierlichen Fluss von Isofluran. Mit einem elektrischen Rasierer, entfernen Sie die Haare aus dem hinteren Gliedmaßen. Bewerben Enthaarungscreme gründlich zu entfernen Haare.
- Platzieren Sie die Maus in Rückenlage über einen drapiert Heizkissen auf dem OP-Tisch, und verbinden Sie es mit einem kontinuierlichen Fluss von Isofluran. Erweitern und sichere das Hinterbein mit einem Stück Klebeband. Sobald das Hinterbein ist sicher, wischen Sie die Haut mit drei wechselnden betadine und Alkohol scheuert. Für den Rest des chirurgischen Eingriffs, verwenden Sie einen Dissektionsmikroskop bei 10X oder 20X Vergrößerung, um eine vergrößerte Ansicht der Hinterlauf Region zu erhalten.
- Mit feinen Pinzetten und chirurgische Schere, einen Einschnitt der Haut, ca. 1 cm lang, vom Knie zum medialen Oberschenkel.
- Mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS)-befeuchteten feinen spitzen Wattestäbchen vorsichtig wegzuwischen subkutane Fettgewebe um die Oberschenkelmuskulatur.
- Next gelten die Brenneisen quer zur incise und sezieren durch das subkutane Fettgewebe die zugrunde liegenden Oberschenkelarterie offenbaren.
- Verwenden Sie einen Haken, um die Wunde zu öffnen und einen besseren Blick auf die untere Extremität Gefäßsystem zu erhalten.
- Mit feinen Zange und einem feinen zeigte Wattestäbchen vorsichtig durchstoßen die membranöse femoral Mantel der neurovaskulären Bündel freizulegen.
- Dann mit einem sauberen Satz von feinen Pinzette und Wattestäbchen, sezieren und trennen Sie die Femoralarterie aus der V. femoralis und Nerven am proximalen Lage in der Nähe der Leiste. Nach der Präparation, übergeben Sie einen Strang von 7-0 Seidenfaden unter dem proximalen Ende der Femoralarterie. Verschließen den proximalen A. femoralis mit doppelseitigem Knoten. Legen Sie die Krawatte auf dem Schiff als proximal in die Wunde wie möglich, um Länge für die zweite Krawatte und eine dazwischen liegende Segment, das durchtrennt werden zu lassen.
- Trennen Sie die Femoralarterie aus der V. femoralis am distalen Lage in der Nähe des Knies. Pass ein Strang von 7-0 Naht unterhalb des distalen Endes der Femoralarterie proximal der A. poplitea. Verschließen das Gefäß mit doppelten Knoten.
- Verschließen distalen A. femoralis mit einem zweiten Satz der doppelten Knoten genau proximal der erste Satz von Knoten. Dieser zweite Satz der Nähte wird zum Greifen der Arterie während der Transaktion Verfahren verwendet werden.
- Auch zum Greifen Zwecke, verschließen den proximalen A. femoralis mit einem zweiten Satz der doppelten Knoten unmittelbar distal der erste Satz von Knoten.
- Transect Segment der Femoralarterie zwischen den distalen und proximalen Knoten mit einer feinen spitzen Wattestäbchen und ein Paar Frühling Schere. Seien Sie vorsichtig, nicht zu durchbohren die Vena femoralis Wand.
- Entfernen Sie den Haken und schließen Sie den Schnitt mit 5-0 Vicryl Nahtmaterial. Diese Nähte müssen nicht zu einem späteren Zeitpunkt entfernt werden, da sie sich auflösen auf eigene Faust.
- Sobald der Schnitt wird geschlossen, statt das Tier auf einem drapierten Heizkissen in die Erholung Käfig und überwachen kontinuierlich bis wach.
- Nach Tier 1 Stunde wieder, mit der Laser-Doppler-Durchblutung Schritt fort, um die Ischämie-Induktion zu bestätigen.
2. Laser-Doppler-Durchblutung
- Zu Beginn der Laser-Doppler-Perfusion Schritt legen Sie die Maus in die Narkose Kammer mit 1-3% Isofluran in 100% Sauerstoff bei einer Durchflussrate von 1l/min.
- Lassen Sie die Maus in die Induktion Kammer, bis es reagiert auf äußere Reize ist. Dann entfernen Sie das Tier von der Induktion Kammer. Es wird empfohlen, das Narkosemittel aus dem Karton vor bündig mit der Deckelöffnung, zur Verringerung der Exposition zu Isofluran zu verringern.
- Legen Sie das Tier auf der Pre-OP-Tisch verbunden kontinuierlichen Fluss von Isofluran. Dann entfernen Sie die Haare aus dem hinteren Gliedmaßen mit einem elektrischen Rasierer von Enthaarungscreme als notwendig an.
- Nach dem Entfernen der Haare,Ort des Tieres auf einem 37 ° C erwärmten Oberfläche für 5 Minuten unter kontinuierlichem Fluss von Isofluran. Überwachen Sie die Kerntemperatur euthermia zu gewährleisten, wie Temperaturschwankungen deutlich beeinflussen wird Perfusion.
- Nach 5 Minuten, legen Sie das Tier in Rückenlage auf eine nicht reflektierende Licht absorbierende Oberfläche, z. B. grün-buntes Tuch, verbunden mit einem kontinuierlichen Fluss von Isofluran. Verlängern Sie die Hinterbeine.
- Als nächstes auf der Laser-Doppler-Imager und die Erfassungs-Software ab und initialisiert die Software. Geben Sie die Größe des Sichtfeldes und Auflösung. Am besten ist es immer das Sichtfeld und Pixeldichte konsequente zwischen Tieren, damit eine spätere Analyse zu erleichtern.
- Öffnen Sie eine neue Datei. Drücken Sie Start, um mit dem Erwerb der Bilddaten. Im Allgemeinen die Imager erkennt automatisch die Entfernung von der Maus, aber wenn Sie dazu aufgefordert werden, geben die Entfernung des Tieres auf die Imager. Der Laser zeigt die Grenzen des Gesichtsfeldes und starten Sie dann Daten erfasst.
- Nach Übernahme abgeschlossen ist, wird das Bild zunächst auf eine Reihe von Farben, die bezeichnend für das Niveau der Durchblutung der Beine zu zeigen. Die Farben können auf einen bestimmten Perfusion Bereich eingestellt werden, um besser vergleichen Daten zwischen den Tieren.
- Wenn die Datenerfassung abgeschlossen ist, speichern Sie die Datei.
- Dann wieder das Tier zur Erholung Käfig und Überwachung der Tiere kontinuierlich bis wach.
- Um die Daten analysieren, verwenden Sie die Schwelle Anpassung in der Analyse-Software, um alle Hintergrundgeräusche zu subtrahieren. Ein Schwellenwert von 0,2 ist in der Regel ein vernünftiger Wert. Wählen Sie 2-Regionen von Interesse, oder ROIs, dass jedes Hinterbein Bereich abdecken. Eine Vielzahl von Sehenswürdigkeiten können Sie den ROI zwischen Gliedmaßen und Tieren zu standardisieren. Dann die mittlere Perfusion und der Variabilität in den ROI. Die Perfusion Differenz und Perfusion Verhältnis zwischen der ischämischen Extremität und Kontrolle des Körpers können dann leicht bestimmt werden.
- Dieser Vorgang kann wiederholt werden, um Veränderungen in der hinteren Gliedmaßen Perfusion im Laufe der Zeit zu folgen. Bei einem gewünschten Zeitpunkt kann das Tier für die Beurteilung von Gewebe-Funktion und der Vergleich mit Perfusion Bilddaten eingeschläfert werden.
3. Repräsentative Ergebnisse:
Die Anatomie der Hinterlauf Gefäßsystem ist in Abbildung 1 2 gezeigt. Eine repräsentative Darstellung der Hinterlauf nach Femoralarterie Explantation ist in Abbildung 2 dargestellt. Um zu bestätigen, die Induktion der Ischämie auf die hinteren Gliedmaßen, zeigt Laser-Doppler-Perfusion Bildanalyse eine drastische Reduzierung der Durchblutung der ischämischen Extremität, im Vergleich zu der Kontrolle des Körpers, wie in Abbildung 3 dargestellt.
Abbildung 1. Anatomy of the Hinterlauf Gefäßsystem. Sternchen zeigen die Standorte der Ligation für die Induktion der hinteren Gliedmaßen Ischämie.
Abbildung 2. Representative Diagramm, welches die Anatomie der Hinterlauf nach Unterbindung der A. femoralis am proximalen und distalen Seiten, die nach der Entfernung der Femoralarterie.
Abbildung 3. Laser-Doppler-Bildern, die zeigen Blutfluss, bevor und nachdem die Induktion von Ischämie der linken Hinterlauf (durch Pfeil gekennzeichnet).
Discussion
Es gibt einige Quellen der Variabilität zu berücksichtigen bei der Planung und Durchführung Hinterlauf Ischämie-Modellen. Erstens kann das Niveau der Ischämie nach dem Standort der Ligation in Bezug auf die von Seitenästen variieren. Daher ist für die Konsistenz des Modells sollten die Tiere erleiden das gleiche Maß an Arterienligatur. Eine weitere Quelle der Variabilität in ischämischen Erholung auf das Alter der Tiere ist im Zusammenhang mit jungen Tieren (6-8 Wochen alt) mit schneller und vollständiger Verwertungsquoten als ältere Tiere (8-10 Monate alt), geändert durch hämodynamische (dh beurteilt Laser-Doppler-Perfusion) oder funktionelle (dh Laufband Test) misst. Für Studien, in der man der Beurteilung eines Angiogenese-Medikament, kann es vorteilhaft sein, ältere Tiere zu verwenden, da ein größerer Unterschied zwischen den Gruppen mit einer therapeutischen Intervention beobachtet werden können. Umgekehrt gilt für Studien, in der man die Beurteilung einer anti-angiogenen Faktor ist, kann es vorteilhaft sein, jüngere Tiere zu verwenden, um Wirkung der Größe 3 zu maximieren.
Wenn richtig ausgeführt, sollte es minimal Komplikationen wie Blutungen, Infektionen oder Sterblichkeit. Kommt es zu Blutungen durch zufällige Störungen der V. femoralis oder andere Schiffe, unter leichten Druck mit einem sterilen Wattestäbchen oder Mull auf der Website von Blutungen angewendet werden sollte, bis die Blutung aufhört. Tiere mit Anzeichen einer Infektion sollte mit Antiinfektiva behandelt werden. Tiere, die signifikante Gangrän kann beeuthanized müssen. Diese Komplikation ist häufiger bei älteren Tieren, und in einigen Stämmen, wie BALB c Mäusen 4. Darüber hinaus kann das Hinterbein Ischämie-Modell zu leichten bis mäßig starken Schmerzen. Daher sollten Analgetika wie Buprenorphin oder Carprofen verabreicht, wie für die Behandlung von Schmerz benötigt werden, entsprechend den Empfehlungen des IACUC.
Zusammenfassend haben wir eine einfache und reproduzierbare Methode zur Untersuchung PAD in einem Mausmodell der hinteren Gliedmaßen Ischämie demonstriert. Die hinteren Gliedmaßen Ischämie-Modell mit Laser-Doppler-Imaging-Analyse ist ein ausgezeichnetes System zur Untersuchung von Gefäßerkrankungen und für die Beurteilung der therapeutischen Kandidaten.
Acknowledgments
Die Autoren danken Andrea Axtell, Satoshi Itoh, MD, Jeff Velotta, MD, Grant Hoyt, Robert C. Robbins, MD, Jin Yu, MD, Tim Doyle, PhD, und die Stanford Small Animal Imaging Core für die technische Unterstützung. Die Autoren danken AM Bickford, Inc. für die Unterstützung der tierärztlichen Einrichtungen. Diese Arbeit wurde durch Forschungsstipendien der National Institutes of Health (R01 HL-75774, R01 CA098303, R21 HL085743, 1K12 HL087746), der California Tobacco Related Disease Research Program der University of California (15IT-0257 und 1514RT-0169) unterstützt und das California Institute for Regenerative Medicine (RS1-00183). NH wird durch ein Stipendium der American Heart Association unterstützt.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Tools | Tool | Fine Science Tools | ||
| Constix Cotton Swabs | Tool | Contec | SC-4 | |
| Betadine (Povidone-iodine) | Reagent | PDI | ||
| 70% alcohol | Reagent | Kendall | ||
| Phosphate Buffered Saline | Reagent | Invitrogen | ||
| 7-0 silk suture | Tool | Genzyme | ||
| 5-0 vicryl suture | Tool | Ethicon Inc. | ||
| Electric shaver | Tool | GE Healthcare | ||
| Cautery | Tool | Baxter Internationl Inc. | ||
| Laser Doppler and PeriScan PIM 3 System | Equipment | Perimed |
References
- Huang, N. F., Niiyama, H., De, A., Cooke, J. P., , Transplantation and non-invasive tracking of embryonic stem cell-derived endothelial cells for treatment of hindlimb ischemia. J Vis Exp. , (2008).
- Cook, M. J. The anatomy of the laboratory mouse. , Academic Press. New York. (1976).
- Niiyama, H., Kai, H., Yamamoto, T., Shimada, T., Sasaki, K., Murohara, T., Egashira, K., Imaizumi, T. Roles of endogenous monocyte chemoattractant protein-1 in ischemia-induced neovascularization. J. Am. Coll. Cardiol. 44, 661-666 (2004).
- Dokun, A. O., Keum, S., Hazarika, S., Li, Y., Lamonte, G. M., Wheeler, F., Marchuk, D. A., Annex, B. H. A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia. Circulation. 117, 1207-1215 (2008).
