Summary
Хирургическая процедура для индукции односторонних ишемии задних конечностей свидетельствует, с подтверждением ишемии лазерным перфузии Доплера.
Abstract
В Соединенных Штатах, заболевания периферических артериальных (PAD) страдают около 10 миллионов человек, а также распространение по всему миру. Медицинские терапии для облегчения симптомов ограничены. Хирургическое или эндоваскулярных вмешательств являются полезными для некоторых людей, но и долгосрочные результаты часто разочаровывают. В результате, существует необходимость разработки новых методов лечения для лечения PAD. Мышиные подготовки ишемии задних конечностей представляет собой модель PAD, и полезно для тестирования новых методов лечения. По сравнению с другими моделями ишемии тканей, таких как ишемическая или мозговой артерии перевязки, перевязки бедренной артерии обеспечивает простую модель ишемической ткани. Другие преимущества этой модели легкость доступа к бедренной артерии и низкой смертности.
В этом видео, мы демонстрируем методологии мышиной модели односторонних ишемии hindimb. Конкретные материалы и процедуры создания и оценки модели будет описана, в том числе оценку перфузии конечностей при лазерной допплеровской визуализации. Этот протокол также может быть использована для трансплантации и неинвазивные отслеживания клеток, о чем свидетельствует Huang и соавт. 1.
Protocol
1. Индукция Односторонние ишемии задней конечности
- Хирургические инструменты, необходимые для этой операции включают в себя: штраф отметил щипцы, пинцеты отметил, весна ножницы, хирургические ножницы, иглодержатель, и втягивающим. Мы делаем наши собственные втягивающим помощью скрепки, потому что это меньше, чем коммерчески доступные преднатяжителями. Стерилизовать эти инструменты до операции по автоклаве или горячей бусинка стерилизатор. Прижигания инструмент и стерильный штраф отметил ватные тампоны также будут необходимы для этой операции. Рекомендуется, чтобы инструменты повторно стерилизуют при советы по мере необходимости во время процедуры.
- Когда инструменты готовы, поместите мышь в камере наркоза индукция содержащие 1-3% изофлуран в 100% кислорода при скорости потока 1L/min.
- Оставьте мышь в индукции камере, пока он не реагирует на внешние раздражители. Затем удалите животное от индукции камеры. Рекомендуется, чтобы избавиться от анестезии окно до открытия крышки, для уменьшения воздействия на оператора в изофлуран.
- Затем поместите животное в лежачем положении на предварительно операционном столе и подключить его к непрерывным потоком изофлуран. Использование электробритвы, удалить волосы из задних конечностей. Нанесите крем для удаления волос тщательно удалить волосы.
- Наведите в положении лежа на драпированные подогревом накладка на операционном столе, и подключить его к непрерывным потоком изофлуран. Расширение и безопасной задних конечностей с ленты. Как только задние конечности находится в безопасности, протирать кожу трех чередующихся бетадин и алкоголя скрабов. На оставшуюся часть хирургической процедуры, используйте рассечение микроскопа 10х или 20х увеличением, чтобы получить увеличенное изображение задней конечности регионе.
- Использование тонких хирургических щипцов и ножниц, делают разрез кожи, примерно 1 см длиной, от колена к медиальной бедра.
- Использование фосфатным буферным раствором (PBS) увлажненных штраф отметил ватных тампонов, слегка смахнуть подкожной жировой ткани, окружающие мышцу бедра.
- Далее, применяют прижигание поперек надрезать и анализировать через подкожную жировую ткань, чтобы выявить основные бедренной артерии.
- Используйте втягивающим, чтобы открыть раны и получить более четкое представление о нижних конечностей сосудов.
- Использование тонких щипцов и штраф отметил ватным тампоном, слегка прокалывают через мембранные бедренной оболочки подвергать сосудисто-нервный пучок.
- Затем, используя чистую множество мелких пинцетом и ватным тампоном, препарировать и отдельных бедренной артерии от бедренной вены и нерв в проксимальных расположение вблизи паха. После вскрытия, проходят нити 7-0 шелковых шва под проксимального конца бедренной артерии. Окклюзии проксимального отдела бедренной артерии помощью двойных узлов. Место галстук на судне в качестве проксимального в ране, как это возможно, чтобы оставить длину галстука и второй промежуточный сегмент, который будет перерезана.
- Отдельные бедренной артерии от бедренной вены на дистальном месте рядом с коленом. Pass прядь 7-0 шва под дистального конца бедренной артерии проксимальнее подколенной артерии. Закупорить сосуд помощью двойных узлов.
- Окклюзии дистальной бедренной артерии с второй набор двойных узлов просто проксимальнее первого набора узлов. Второй комплекс швы будут использованы для захвата артерии во время сделки процедуры.
- Аналогично, для захвата целей, закрывают проксимального отдела бедренной артерии с второй набор двойных узлов только дистальнее первого набора узлов.
- Трансекта сегменте бедренную артерию между дистальной и проксимальной узлов с тонкой отметил ватный тампон и пару весной ножницами. Будьте осторожны, чтобы не проткнуть стену бедренной вены.
- Удалить втягивающим и закрыть разрез использованием 5-0 Викрил швов. Эти швы не должны быть удалены в более позднее время, как они растворяются сами по себе.
- Как только разрез закрыт, место животного в верхней части драпированные подогревом площадку в восстановлении клетку и монитор непрерывно, пока не проснулись.
- После животного восстановилась в течение 1 часа, выполните крови лазерный доплеровский шаг перфузии с целью подтверждения ишемии индукции.
2. Лазерная допплеровская кровотока
- Для начала перфузии лазерного доплеровского шаг, при наведении в камеру анестезии индукции содержащие 1-3% изофлуран в 100% кислорода при скорости потока 1L/min.
- Оставьте мышь в индукции камере, пока он не реагирует на внешние раздражители. Затем удалите животное от индукции камеры. Рекомендуется, чтобы избавиться от анестезии окно до открытия крышки, для уменьшения воздействия на оператора в изофлуран.
- Место животное на предварительно операционном столе связано с непрерывным потоком изофлуран. Затем удалите волосы от задних конечностей использованием электробритвы следуют удаления волос крем по мере необходимости.
- После удаления волос,место животного на 37 ° C нагретой поверхности в течение 5 минут при непрерывном потоке изофлуран. Монитор температуры ядра для обеспечения euthermia, как изменения температуры будет заметно влиять перфузии.
- Через 5 минут, поместите животное в лежачем положении на антибликовым поглощающих свет поверхности, например, зеленого цвета, ткани, связанные с непрерывным потоком изофлуран. Расширение задних конечностей.
- Затем включите лазерного доплеровского томографа и приобретение программного обеспечения и инициализации программного обеспечения. Укажите размер поля зрения и разрешение. Лучше всего держать в поле зрения и плотность пикселей последовательной между животными, с тем чтобы в будущем анализ проще.
- Откройте новый файл. Пресса начала начать приобретения данных изображений. Как правило, тепловизор автоматически определяет расстояние мышь, но если будет предложено указать расстояние животных в тепловизор. Лазер-шоу границ поля зрения, а затем начать сбор данных.
- После приобретения завершен, изображение начнет показывать диапазон цветов, которые указывают на уровень кровотока в ногах. Цвета могут быть установлены в определенном диапазоне перфузии лучше сравнивать данные между животными.
- Когда сбор данных завершен, сохраните файл.
- Затем вернитесь животное восстановления клетки и мониторинг животного непрерывно, пока не проснулись.
- Для анализа данных, используйте настройки порога в программное обеспечение для анализа вычесть любые фоновые шумы. Порог в 0,2, как правило, в разумных пределах. Выберите 2 регионах, представляющих интерес, или трансформирования, которые покрывают каждый задних конечностей области. Различные ориентиры могут быть использованы для стандартизации ROI между конечностями и животных. Затем определить среднее перфузии и изменчивости в ROI. Разница перфузии и перфузионного соотношения между ишемической конечностей и контроль конечности могут быть легко определены.
- Эта процедура может быть повторена, чтобы следить за изменениями в задних конечностей перфузии с течением времени. В нужное время точки, животное может быть умерщвлены для оценки функции тканей и сравнение с данными перфузии изображения.
3. Представитель Результаты:
Анатомия задней конечности сосудистую показано на рисунке 1 2. Представитель диаграмма задних конечностей после бедренной артерии эксплантации показано на рисунке 2. Для подтверждения индукции ишемии на задних конечностей, лазерная допплеровская перфузии анализа изображений демонстрирует значительное уменьшение притока крови к ишемической конечности, по сравнению с контролем конечности, как показано на рисунке 3.
Рисунок 1. Анатомия сосудистой задних конечностей. Звездочки указывают места перевязки для индукции задних конечностей ишемии.
Рисунок 2. Представителю диаграмма, показывающая анатомию задней конечности после перевязки бедренной артерии в проксимальных и дистальных участков после удаления бедренной артерии.
Рисунок 3. Лазерные доплеровские изображения, показывающие кровотока до и после индукции ишемии в левой задней конечности (указано стрелкой).
Discussion
Есть несколько источников изменчивости, чтобы рассмотреть при планировании и проведении задних конечностей модели ишемии. Во-первых, уровень ишемии может различаться в зависимости от расположения лигирования в отношении этой боковых ветвей. Таким образом, для последовательности модели, животные должны пройти тот же уровень артериального труб. Другой источник изменчивости при ишемической восстановление, связанные с возрастом животных, с маленькими животными (6-8 недель), имеющие более быстрого и полного восстановления темпами, чем старых животных (8-10 месяцев), по оценке гемодинамики (т.е. лазерного доплеровского перфузии) или функциональные (например, тестирование беговой дорожке) мер. Для исследований, в которых один является оценка ангиогенных агентом, он может быть предпочтительнее использовать старых животных, потому что большая разница между группами могут наблюдаться с терапевтического вмешательства. Наоборот, для исследований, в которых один является оценка антиангиогенного фактор, он может быть предпочтительнее использовать более молодых животных, чтобы максимизировать эффект 3 размера.
Если выполнены правильно, там должны быть минимальными осложнениями, такими как кровотечение, инфекция, или смертности. Если кровотечение происходит путем случайного нарушения бедренную вену или других судов, умеренное давление со стерильным ватным тампоном наконечником аппликатором или марлю следует наносить на месте кровоизлияния, пока кровотечение не остановится. Животные демонстрируют признаки инфекции следует лечить антибактериальными агентами. Животные, демонстрирующие значительные гангрена, возможно, потребуется beeuthanized. Это осложнение чаще встречается у взрослых животных, а в некоторых штаммов, например, с мышей BALB 4. Кроме того, модель задних конечностей ишемии может привести к легкой или умеренной боли. Таким образом, анальгетики, такие как бупренорфин или carprofen следует вводить по мере необходимости для лечения боли, в соответствии с рекомендациями IACUC.
В заключение, мы продемонстрировали простой и воспроизводимый метод для изучения ОРП в мышиной модели задних конечностей ишемии. Модели ишемии задней конечности с лазерным анализ допплер является отличной системой для изучения сосудистой патологии, а также для оценки терапевтических кандидатов.
Acknowledgments
Авторы выражают благодарность Андреа Акстелл, Сатоши Ито, доктор медицинских наук, Джефф Velotta, доктор медицинских наук, Грант Хойт, Роберт С. Роббинс, доктор медицинских наук, Цзинь Юй, доктор медицинских наук, Тим Дойл, кандидат наук, и Стэнфордского небольшое ядро изображениями животных для оказания технической помощи. Авторы также выражают благодарность А. М. Бикфорд, Inc для поддержки ветеринарное оборудование. Это исследование было поддержано исследовательских грантов от Национального института здоровья (R01 HL-75774, R01 CA098303, R21 HL085743, 1K12 HL087746), Табак Калифорнии соответствующей программы исследований Заболевание Калифорнийского университета (15IT-0257 и 1514RT-0169) , и Калифорнийского института регенеративной медицины (RS1-00183). NH поддерживает общение с Американской ассоциации сердца.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Tools | Tool | Fine Science Tools | ||
| Constix Cotton Swabs | Tool | Contec | SC-4 | |
| Betadine (Povidone-iodine) | Reagent | PDI | ||
| 70% alcohol | Reagent | Kendall | ||
| Phosphate Buffered Saline | Reagent | Invitrogen | ||
| 7-0 silk suture | Tool | Genzyme | ||
| 5-0 vicryl suture | Tool | Ethicon Inc. | ||
| Electric shaver | Tool | GE Healthcare | ||
| Cautery | Tool | Baxter Internationl Inc. | ||
| Laser Doppler and PeriScan PIM 3 System | Equipment | Perimed |
References
- Huang, N. F., Niiyama, H., De, A., Cooke, J. P., , Transplantation and non-invasive tracking of embryonic stem cell-derived endothelial cells for treatment of hindlimb ischemia. J Vis Exp. , (2008).
- Cook, M. J. The anatomy of the laboratory mouse. , Academic Press. New York. (1976).
- Niiyama, H., Kai, H., Yamamoto, T., Shimada, T., Sasaki, K., Murohara, T., Egashira, K., Imaizumi, T. Roles of endogenous monocyte chemoattractant protein-1 in ischemia-induced neovascularization. J. Am. Coll. Cardiol. 44, 661-666 (2004).
- Dokun, A. O., Keum, S., Hazarika, S., Li, Y., Lamonte, G. M., Wheeler, F., Marchuk, D. A., Annex, B. H. A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia. Circulation. 117, 1207-1215 (2008).
