Summary
Microcontact impressão é usado extensivamente às proteínas padrão e outras moléculas nas superfícies de materiais. Demonstramos as etapas básicas desse processo, carimbar padrões de fibronectina em vidro.
Abstract
A capacidade de proteínas e outras biomoléculas padrão sobre substratos é importante para captar a complexidade espacial do ambiente extracelular. Desenvolvimento da impressão microcontact pelo grupo Whitesides (
Protocol
1. Preparação de soluções e materiais
Estes passos devem ser realizados vários dias de antecedência.
- Lamínulas de vidro. Lamínulas foram limpos por imersão por 10 minutos em uma solução de detergente Linbro provêm 7X: água, misturados em um 1: 3 ratio e aquecida, com agitação, até claro. Lamínulas foram lavadas exaustivamente com água deionizada, e depois cozido a 450 ° C por 6 horas. Carregando lamínulas em racks coloração de cerâmica (veja Os reagentes) simplificou o processo.
- Solução de proteína para carimbar. Fibronectina reconstituir seguir as instruções dos fabricantes para uma solução estoque de uma concentração mg / ml.
2. Elenco selos do mestre topológica
Estes passos podem ser realizados vários dias de antecedência. Selos loja padrão-up em um prato coberto, como um prato de cultura de tecidos.
- Remover a poeira solta de mestre usando um fluxo de ar comprimido, ar filtrado ou gás inerte.
- Coloque o mestre lado, modelado para cima, no fundo de um prato de plástico maior que o mestre. 60 - ou 100 mm de placas de cultura de tecidos são bem adaptados para esta finalidade.
- Em um tubo de centrifugação de poliestireno de 50 ml, combine os componentes Sylgard na proporção de agente de cura: base de elastômero de 1: 10 por peso. Misturar bem utilizando um dispositivo de plástico, como uma pipeta descartável. Prepare pelo menos 0,2 ml de elastômero por centímetro quadrado de área prato.
- Centrifugar o tubo de 50 ml a 300 G por 5 min para remover bolhas de ar.
- Despeje o elastômero sobre o mestre, em seguida, coloque em um dessecador, sob vácuo, por 30 minutos.
- Cura do elastômero em um forno a 65 ° C por pelo menos 2 horas. Cura em temperaturas mais altas e para resultados mais vezes em mais aguerrida elastômero. Deixe esfriar até a temperatura ambiente.
- Separe a folha de selos do mestre.
3. Microcontact impressão de fibronectina em vidro
- Cortar um único carimbo. Carimbos medindo 4 mm x 4 mm a 1 cm X 1 cm de área e 1-2 mm de espessura são mais fáceis de começar. Coloque o lado padrão acima em uma lâmina de vidro ou prato de plástico.
- Coloque selo em um aspirador de plasma, e processo, sob vácuo, por 30 segundos. A Harrick Científico limpo plasma (vide acessórios), fixado em sua configuração mais alta saída será tornar a superfície hidrofílica PDMS. Mais vezes resultar em quebra do elastômero.
- Diluir a solução fibronectina com água deionizada a uma concentração de estampagem de 50 mcg / ml.
- Coloque uma pequena gota (10-50 L) de estamparia solução no selo. Ele vai se espalhar por toda a superfície hidrofílica. Adicionar única solução o suficiente para que a queda cobre o selo, mas não é executado sobre as bordas. Vamos absorver proteína para carimbar por 5 minutos.
- Usando um ® Kimwipe ou lenço de papel limpo outros, pavio a maior parte da solução de proteína do selo, sem tocar na região modelada.
- Secar a solução restante do selo sob um fluxo de limpeza, gás seco e inerte, como nitrogênio.
- Usando uma pinça, retire o selo da lâmina de vidro, invertido, e coloque em contato com a lamela de vidro limpo (a superfície a ser modelada). Coloque um peso em cima para promover um bom contato. O peso específico que fornece a melhor padronização é dependente do tamanho do selo e padrão; começar com um peso de 5 g, e ajuste entre peças estampadas. Deixe selo em contato com a superfície de um minuto.
- Cuidadosamente desmontar a pilha, e carimbo separado lamela.
- Vigorosamente lavar as lamelas padronizadas em PBS, seguido de água deionizada, para remover proteína que não é adsorvido à superfície. Lamela seco sob corrente de nitrogênio.
Resultados representante
Microcontact impressão é um processo poderoso para moléculas padronização em superfícies. Este processo tem a capacidade de criar recursos com dimensões variando de dezenas de micrômetros de centenas de nanômetros, na fig. 1A, o logos à esquerda estão cada 200 mM de altura, enquanto as manchas verdes ilustrado na figura. 1B são 1 m de diâmetro e espaçadas em intervalos de 4 M, medido de centro a centro. Fig. 1B também ilustra uma propriedade poderosa da impressão microcontact, ou seja, que ela é e processo aditivo. Várias rodadas de impressão microcontact pode ser aplicada a uma única superfície para criar sistemas multicomponentes 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O processo de impressão microcontact é conceitualmente simples e muito robusto, tendo sido aplicada a padronização uma ampla gama de moléculas em uma variedade de substratos. No entanto, este processo continua a ser algo de uma arte. A geometria específica do padrão a ser criada, a proteína a ser modelada, peso aplicado, e revestimento / condições stamping afetam a qualidade de estamparia. Por exemplo, muito pouco de peso, aplicada a características de grande porte, muitas vezes resulta em falhas no padrão de como pode ser visto no logotipo superior direito da Figura. 1A. Por outro lado, muito peso irá causar flacidez e queda do selo, o que resultou na deposição de proteína não intencionais nas regiões entre os padrões features.As um segundo exemplo, proteínas específicas (tais como anticorpos) padrão com melhor fidelidade se a etapa de tratamento de plasma é omitido, deixando o PDMS hidrofílico. A estamparia de fibronectina em vidro é aqui apresentada como um ponto de partida para tais modificações e otimizações, demonstrando as técnicas básicas desse processo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasma Cleaner | Harrick Scientific Products, Inc. | PDC-32G | ||
| Desiccator | Nalge Nunc international | 5315-0150 | ||
| PBS | Reagent | Invitrogen | 10010-072 | |
| Protein labeling kit | Reagent | Invitrogen | A30006 | |
| Fibronectin | Reagent | Sigma-Aldrich | F2006 | |
| Staining rack | Reagent | Thomas Scientific | 8542E40 | |
| Coverslips | Reagent | Fisher Scientific | 12-544-12 | |
| Sylgard 184 | Reagent | Ellsworth Adhesives | 184 Sil Elast Kit | |
| Diffraction Grating | Reagent | Edmund Scientific | 3040267 |
References
- Chen, C. S. Geometric control of cell life and death. Science. 276, 1425-1425 (1997).
- Kumar, A., Whitesides, G. M. Features of Gold Having Micrometer to Centimeter Dimensions can be Formed Through a Combination of Stamping with an Elastomeric Stamp and an Alkanethiol "Ink" Followed by Chemical Etching. Applied Physics Letters. 63, 4-4 (1993).
- St. John, P. M. Preferential Glial Cell Attachment to Microcontact-printed Surfaces. Journal of Neuroscience Methods. 75, 171-171 (1997).
- Kam, L., Boxer, S. G. Cell adhesion to protein-micropatterned-supported lipid bilayer membranes. Journal of Biomedical Materials Research. 55, 487-487 (2001).
- Kung, L. A., Kam, L., Hovis, J. S., Boxer, S. G. Patterning Hybrid Surfaces of Proteins and Supported Lipid Bilayers. Langmuir. 16, 6773-6773 (2000).
- Shen, K., Thomas, V. K., Dustin, M. L., Kam, L. C. Micropatterning of costimulatory ligands enhances CD4+ T cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 7791-7791 (2008).
- Shi, P., Shen, K., Kam, L. C. Local presentation of L1 and N-cadherin in multicomponent, microscale patterns differentially direct neuron function in vitro. Developmental Neurobiology. 67, 1765-1765 (2007).
