Summary
Stampa microcontact viene utilizzato estensivamente alle proteine modello e altre molecole sulle superfici dei materiali. Dimostriamo i passaggi fondamentali di questo processo, stampaggio modelli di fibronectina su vetro.
Abstract
La capacità di proteine modello e altre biomolecole su substrati è importante per catturare la complessità spaziale dell'ambiente extracellulare. Sviluppo della stampa microcontatto dal gruppo Whitesides (
Protocol
1. Preparazione delle soluzioni e dei materiali
Questi passaggi devono essere effettuati diversi giorni di anticipo.
- Vetrini coprioggetto. Coprioggetto sono stati puliti per immersione per 10 minuti in una soluzione di detersivo Linbro 7X: acqua, mescolata ad un 1: 3 ratio e riscaldato, mescolando, fino a non toccare. Coprioggetto sono stati ampiamente sciacquati con acqua deionizzata, e poi cotto al forno a 450 ° C per 6 ore. Caricamento coprioggetto in rack colorazione ceramica (vedi reagenti) semplificato questo processo.
- Soluzione proteica per stampaggio. Ricostituire fibronectina seguendo le istruzioni del produttore per una soluzione madre di 1 mg / ml di concentrazione.
2. Cast francobolli dal master topologico
Questi passaggi possono essere eseguiti diversi giorni di anticipo. Francobolli negozio modello-up in un piatto coperto, come un piatto di coltura di tessuti.
- Rimuovere la polvere dal master utilizzando un flusso di compressa, aria filtrata o gas inerte.
- Posizionare il, lato master fantasia alto, sul fondo di un piatto di plastica appena superiore a quella del maestro. 60 - o 100 mm piatti coltura tissutale sono adatte per questo scopo.
- In un tubo di polistirene da 50 ml centrifuga, combinare i componenti Sylgard con un rapporto di catalizzatore: elastomero di base di 1: 10 in peso. Mescolare accuratamente con un dispositivo di plastica, come una pipetta monouso. Preparare almeno 0,2 ml di elastomero per centimetro quadrato di area piatto.
- Centrifugare il tubo da 50 ml a 300 g per 5 minuti per rimuovere le bolle d'aria.
- Versare l'elastomero sopra il maestro, poi posto in un essiccatore, sotto vuoto, per 30 minuti.
- Curare l'elastomero in un forno a 65 ° C per almeno 2 ore. Polimerizzazione a temperature più elevate e più a lungo i risultati in tempi più rigido elastomero. Lasciate raffreddare a temperatura ambiente.
- Separare il foglio di francobolli dal master.
3. Stampa microcontact della fibronectina su vetro
- Tagliare un unico timbro. Francobolli di misura 4 mm x 4 mm a 1 cm x 1 cm in area e 1 - 2 mm di spessore sono più facili per iniziare. Luogo lato modello su un vetrino o un piatto di plastica di piccole dimensioni.
- Posto timbro e un detersivo plasma, e di processo, sotto vuoto, per 30 secondi. Un Harrick scientifico plasma pulito (vedi attrezzature), impostare l'impostazione di massima di uscita renderà la superficie PDMS idrofila. Risultato più volte la rottura del elastomero.
- Diluire la soluzione fibronectina con acqua deionizzata ad una concentrazione stampaggio di 50 mg / ml.
- Mettere una piccola goccia (10 - 50 ml) di stampaggio soluzione sul timbro. Si diffonderà su tutta la superficie idrofila. Aggiungi unica soluzione sufficiente che la caduta di coprire il timbro, ma non travolto i bordi. Lasciate assorbire le proteine di bollo per 5 minuti.
- Utilizzando un Kimwipe ® o su altri tessuti carta pulita, stoppino via la maggior parte della soluzione proteica dal timbro, senza toccare la regione fantasia.
- Asciugare la soluzione rimanente dal timbro sotto un flusso di aria pulita, asciutta, gas inerte, come l'azoto.
- Utilizzando le pinzette, rimuovere il timbro dal vetrino, invertire, e mettere in contatto con il coprioggetto di vetro pulito (la superficie da fantasia). Mettere un peso sopra per promuovere un buon contatto. Il peso specifico che offre la migliore patterning dipende dalla dimensione del timbro e modello; iniziare con un peso di 5 g, e regolare tra stampati. Lascia timbro in contatto con la superficie per 1 minuto.
- Con attenzione smontare la pila, e il timbro separato da coprioggetto.
- Vigorosamente sciacquare il coprioggetto fantasia in PBS, seguita da acqua deionizzata, per rimuovere le proteine che non è assorbito in superficie. Coprioggetto secco sotto corrente di azoto.
Rappresentante Risultati
Stampa microcontact è un potente processo di patterning molecole su superfici. Questo processo ha la capacità di creare funzioni con dimensioni che vanno da decine di micrometri a centinaia di nanometri, in fig. 1A, il logo a sinistra sono ogni 200 micron di altezza, mentre le macchie verdi illustrato nella fig. 1B sono 1 micron di diametro e distanziati ad intervalli di 4 micron, misurato da centro a centro. Fig. 1B illustra anche una proprietà potente di stampa microcontact, cioè che è e di processo additivo. Vari cicli di stampa microcontact può essere applicato a una singola superficie per creare sistemi multicomponente 3.
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Discussion
Il processo di stampa microcontact è concettualmente semplice e molto robusto, essendo stata applicata a patterning una vasta gamma di molecole su una varietà di substrati. Tuttavia, questo processo rimane qualcosa di un'arte. La geometria specifica del modello da creare, le proteine per essere modellata, peso applicato, e di rivestimento / condizioni di stampaggio tutti influiscono sulla qualità di stampaggio. Per esempio, troppo poco peso, applicata a funzioni di grandi dimensioni, si traduce spesso in lacune nel modello di come si può vedere nel logo in alto a destra della fig. 1A. Al contrario, troppo peso provoca rilassamento e il collasso del timbro, con conseguente deposizione involontaria di proteine nelle regioni tra fantasia features.As un secondo esempio, proteine specifiche (come gli anticorpi) modello con una migliore fedeltà se il passo trattamento al plasma viene omesso, lasciando il PDMS idrofilo. La timbratura della fibronectina su vetro è presentato qui come punto di partenza per tali modifiche e ottimizzazioni, dimostrando le tecniche di base di questo processo.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasma Cleaner | Harrick Scientific Products, Inc. | PDC-32G | ||
| Desiccator | Nalge Nunc international | 5315-0150 | ||
| PBS | Reagent | Invitrogen | 10010-072 | |
| Protein labeling kit | Reagent | Invitrogen | A30006 | |
| Fibronectin | Reagent | Sigma-Aldrich | F2006 | |
| Staining rack | Reagent | Thomas Scientific | 8542E40 | |
| Coverslips | Reagent | Fisher Scientific | 12-544-12 | |
| Sylgard 184 | Reagent | Ellsworth Adhesives | 184 Sil Elast Kit | |
| Diffraction Grating | Reagent | Edmund Scientific | 3040267 |
References
- Chen, C. S. Geometric control of cell life and death. Science. 276, 1425-1425 (1997).
- Kumar, A., Whitesides, G. M. Features of Gold Having Micrometer to Centimeter Dimensions can be Formed Through a Combination of Stamping with an Elastomeric Stamp and an Alkanethiol "Ink" Followed by Chemical Etching. Applied Physics Letters. 63, 4-4 (1993).
- St. John, P. M. Preferential Glial Cell Attachment to Microcontact-printed Surfaces. Journal of Neuroscience Methods. 75, 171-171 (1997).
- Kam, L., Boxer, S. G. Cell adhesion to protein-micropatterned-supported lipid bilayer membranes. Journal of Biomedical Materials Research. 55, 487-487 (2001).
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- Shi, P., Shen, K., Kam, L. C. Local presentation of L1 and N-cadherin in multicomponent, microscale patterns differentially direct neuron function in vitro. Developmental Neurobiology. 67, 1765-1765 (2007).
