Summary
Microcontact afdrukken wordt op grote schaal gebruikt voor het patroon eiwitten en andere moleculen op materiaal oppervlakken. Tonen we de basisstappen van dit proces, stempelen patronen van fibronectine op glas.
Abstract
De mogelijkheid om patroon eiwitten en andere biomoleculen op substraten is belangrijk voor het vastleggen van de ruimtelijke complexiteit van het extracellulaire milieu. Ontwikkeling van microcontact afdrukken door de Whitesides groep (
Protocol
1. De voorbereiding van oplossingen en materialen
Deze stappen moeten worden uitgevoerd enkele dagen op voorhand.
- Dekglaasjes. Dekglaasjes werden schoongemaakt door onderdompeling gedurende 10 minuten in een oplossing van Linbro 7X detergent: water, gemengd met een 1: 3 verhouding en verhit, onder roeren, totdat duidelijk. Dekglaasjes werden uitgebreid gespoeld met gedemineraliseerd water, en vervolgens gebakken bij 450 ° C gedurende 6 uur. Het laden van coverslips in keramische vlekken rekken (zie reagentia) vereenvoudigd dit proces.
- Eiwitoplossing voor het stempelen. Reconstitueer fibronectine volgens de instructies van de fabrikant om een voorraad oplossing van 1 mg / ml concentratie.
2. Gegoten stempels van de topologische meester
Deze stappen kunnen worden uitgevoerd enkele dagen op voorhand. Store postzegels patroon-up in een overdekte schotel, zoals een weefselkweek schotel.
- Verwijder los stof van meester met behulp van een stroom van samengeperste, gefilterde lucht of inert gas.
- Plaats de meester, patroon kant naar boven, op de bodem van een plastic schaaltje net groter is dan de meester. 60 - of 100-mm weefselkweek gerechten zijn zeer geschikt voor dit doel.
- In een polystyreen centrifugebuis van 50 ml, combineren de Sylgard componenten in een verhouding van verharder: elastomeer basis van 1: 10 gewicht. Meng grondig met behulp van een plastic apparaat, zoals een wegwerp pipet. Voor te bereiden op zijn minst 0,2 ml van elastomeer per vierkante centimeter van de schotel gebied.
- Centrifugeer de 50 ml buis op 300 G gedurende 5 minuten om luchtbellen te verwijderen.
- Giet het elastomeer over de master, en plaats in een exsiccator, onder vacuüm, gedurende 30 minuten.
- Cure de elastomeer in een oven bij 65 ° C gedurende ten minste 2 uur. Uitharding bij hogere temperaturen en voor langere tijd resulteert in een stijver elastomeer. Laat afkoelen tot kamertemperatuur.
- Afzonderlijk het vel van postzegels van de master.
3. Microcontact printen van fibronectine op glas
- Knip een stempel. Postzegels van 4 mm x 4 mm tot 1 cm x 1 cm in oppervlakte en 1 - 2 mm dikke zijn het gemakkelijkst om mee te beginnen. Plaats patroon zijde naar boven op een glasplaatje of een klein plastic schaaltje.
- Plaats stempel in een plasma schoner, en het proces, onder vacuüm, gedurende 30 seconden. Een Harrick Wetenschappelijke plasma cleaner (zie Equipment), die op zijn hoogste output setting zal maken van de PDMS oppervlak hydrofiel. Langere tijden resulteren in barsten van de elastomeer.
- Verdun de fibronectine oplossing met gedemineraliseerd water tot een stampende concentratie van 50 ug / ml.
- Plaats een kleine druppel (10 - 50 ul) van stempelen oplossing op de postzegel. Het zal verspreid over het hydrofiele oppervlak. Voeg alleen voldoende oplossing dat de daling van de stempel covers, maar loopt niet over de randen. Laat eiwit hecht het zich aan stempel gedurende 5 minuten.
- Met behulp van een Kimwipe ® of andere schone papieren tissue, pit het grootste deel van het eiwit-oplossing uit de stempel, zonder het patroon regio.
- Droog de resterende oplossing van de stempel onder een stroom van schoon, droog, inert gas, zoals stikstof.
- Met behulp van een pincet, verwijder dan de stempel van het glasplaatje, omkeren, en plaats in contact met de gereinigde glazen dekglaasje (het oppervlak een patroon). Leg een gewicht op de top om goed contact te bevorderen. Het soortelijk gewicht dat de beste patronen biedt, is afhankelijk van de postzegel grootte en patroon; beginnen met een gewicht van 5 g, en pas tussen het stampen of stansen. Laat stempel in contact met het oppervlak voor een minuut.
- Voorzichtig uit elkaar halen van de stack, en een aparte stempel van dekglaasje aan.
- Krachtig spoelen het patroon dekglaasje in PBS, gevolgd door gedeïoniseerd water, eiwit dat niet is geadsorbeerd aan het oppervlak te verwijderen. Droog dekglaasje onder een stikstofstroom.
Representatieve resultaten
Microcontact printen is een krachtig proces voor patroonvorming moleculen op oppervlakken. Dit proces heeft de mogelijkheid om functies met afmetingen variërend van enkele tientallen micrometers tot honderden nanometers te maken; in Fig. 1A, de logo's aan de linkerkant zijn elk 200 micrometer in lengte, terwijl de groene plekjes geïllustreerd in Fig. 1B zijn 1 micrometer in diameter en een onderlinge afstand van 4 micrometer intervallen, gemeten hart-op-center. Fig. 1B toont ook een krachtige eigenschap van microcontact afdrukken, namelijk dat het is en additief proces. Meerdere ronden van microcontact printen kan worden toegepast op een oppervlak meercomponentensystemen 3 te creëren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De microcontact drukproces is conceptueel eenvoudig en zeer robuust, dat is toegepast op patronen een brede waaier van moleculen op een verscheidenheid van substraten. Echter, dit proces blijft iets van een kunst. De specifieke geometrie van het patroon te creëren, eiwit te zijn patroon, toegepast gewicht en coating / stempelen voorwaarden alle van invloed op de kwaliteit stampen. Bijvoorbeeld, te weinig gewicht, toegepast op de grote mogelijkheden, resulteert vaak in hiaten in het patroon zoals te zien in de rechterbovenhoek logo van Fig. 1A. Omgekeerd, te veel gewicht zal doorhangen en ineenstorting van de postzegel, met als gevolg onbedoelde afzetting van eiwit in de regio's tussen patroon features.As een tweede voorbeeld, specifieke eiwitten (zoals antilichamen) patroon met een betere betrouwbaarheid als de plasma behandeling stap is weggelaten, het verlaten van de PDMS hydrofiel. De afstempeling van fibronectine op glas wordt hier voorgesteld als een uitgangspunt voor dergelijke wijzigingen en optimalisaties, het aantonen van de basistechnieken van dit proces.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasma Cleaner | Harrick Scientific Products, Inc. | PDC-32G | ||
| Desiccator | Nalge Nunc international | 5315-0150 | ||
| PBS | Reagent | Invitrogen | 10010-072 | |
| Protein labeling kit | Reagent | Invitrogen | A30006 | |
| Fibronectin | Reagent | Sigma-Aldrich | F2006 | |
| Staining rack | Reagent | Thomas Scientific | 8542E40 | |
| Coverslips | Reagent | Fisher Scientific | 12-544-12 | |
| Sylgard 184 | Reagent | Ellsworth Adhesives | 184 Sil Elast Kit | |
| Diffraction Grating | Reagent | Edmund Scientific | 3040267 |
References
- Chen, C. S. Geometric control of cell life and death. Science. 276, 1425-1425 (1997).
- Kumar, A., Whitesides, G. M. Features of Gold Having Micrometer to Centimeter Dimensions can be Formed Through a Combination of Stamping with an Elastomeric Stamp and an Alkanethiol "Ink" Followed by Chemical Etching. Applied Physics Letters. 63, 4-4 (1993).
- St. John, P. M. Preferential Glial Cell Attachment to Microcontact-printed Surfaces. Journal of Neuroscience Methods. 75, 171-171 (1997).
- Kam, L., Boxer, S. G. Cell adhesion to protein-micropatterned-supported lipid bilayer membranes. Journal of Biomedical Materials Research. 55, 487-487 (2001).
- Kung, L. A., Kam, L., Hovis, J. S., Boxer, S. G. Patterning Hybrid Surfaces of Proteins and Supported Lipid Bilayers. Langmuir. 16, 6773-6773 (2000).
- Shen, K., Thomas, V. K., Dustin, M. L., Kam, L. C. Micropatterning of costimulatory ligands enhances CD4+ T cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 7791-7791 (2008).
- Shi, P., Shen, K., Kam, L. C. Local presentation of L1 and N-cadherin in multicomponent, microscale patterns differentially direct neuron function in vitro. Developmental Neurobiology. 67, 1765-1765 (2007).
