Summary
Mikrokontaktdruck ausgiebig in die Muster von Proteinen und anderen Molekülen auf Materialoberflächen eingesetzt. Wir zeigen die wichtigsten Schritte dieses Prozesses, Stanz-Muster von Fibronektin auf Glas.
Abstract
Die Fähigkeit, Muster Proteinen und anderen Biomolekülen auf Substrate ist für die Erfassung der räumlichen Komplexität der extrazellulären Umgebung wichtig. Entwicklung von Mikrokontaktdrucken durch die Whitesides Gruppe (
Protocol
1. Herstellung von Lösungen und Materialien
Diese Schritte sollten durchgeführt werden, mehrere Tage im Voraus.
- Deckgläser. Wasser, bei einer 1 gemischt: Die Deckgläser wurden durch Untertauchen für 10 Minuten in eine Lösung von Linbro 7X Reinigungsmittel gesäubert 3-Verhältnis und unter Rühren erhitzt, bis klar. Deckgläser wurden ausgiebig mit deionisiertem Wasser gespült und anschließend bei 450 ° C für 6 Stunden gebacken. Loading Deckgläser in keramische Färbegestelle (siehe Reagenzien) vereinfacht diesen Prozess.
- Protein-Lösung für Stanz. Rekonstituieren Fibronektin folgenden Anweisungen des Herstellers, um eine Stammlösung von 1 mg / ml Konzentration.
2. Cast Briefmarken aus der topologischen Meister
Diese Schritte können durchgeführt werden, mehrere Tage im Voraus. Shop Briefmarken Muster-up in einer Schale mit Deckel, wie ein Gewebe Kulturschale.
- Entfernen Sie den Staub vom Meister mit einem Strom von Druckluft, gefilterte Luft oder Inertgas.
- Setzen Sie den Meister, gemusterten Seite nach oben in den Boden einer Plastikschale nur größer als der Meister. 60 - oder 100-mm Gewebekulturschalen sind für diesen Zweck gut geeignet.
- In einem Polystyrol 50 ml Zentrifugenröhrchen, kombinieren die Sylgard Komponenten in einem Verhältnis von Härter: Elastomer Basis von 1: 10 nach Gewicht. Nach gründlichem Mischen mit einem Kunststoff-Gerät, wie ein Einweg-Pipette. Bereiten Sie mindestens 0,2 ml aus Elastomer pro Quadratzentimeter Gericht Bereich.
- Zentrifugieren Sie die 50 ml Tube mit 300 g für 5 min, um Luftblasen zu entfernen.
- Gießen Sie das Elastomer über den Master, dann in einem Exsikkator Platz unter Vakuum für 30 Minuten.
- Cure das Elastomer in einem Ofen bei 65 ° C für mindestens 2 Stunden. Aushärtung bei höheren Temperaturen und längeren Zeiten Ergebnisse in steifer Elastomer. Lassen Sie auf Raumtemperatur abkühlen.
- Separate das Blatt Briefmarken aus dem Master.
3. Mikrokontaktdruck von Fibronektin auf Glas
- Schneiden Sie einen einzigen Stempel. Briefmarken von 4 mm x 4 mm bis 1 cm x 1 cm groß und 1 bis 2 mm dick sind am einfachsten zu starten. Legen Sie Muster nach oben auf eine Glasplatte oder kleine Plastikschale.
- Ort Stempel in einen Plasma-Reiniger und Verfahren unter Vakuum für 30 Sekunden. Ein Harrick Scientific Plasma-Reiniger (siehe Ausstattung), am höchsten Output Einstellung gesetzt wird machen die PDMS-Oberfläche hydrophil. Längere Zeiten führen zu Rissen des Elastomers.
- Verdünnen Sie die Fibronektin-Lösung mit deionisiertem Wasser auf eine Stanz-Konzentration von 50 ug / ml.
- Legen Sie einen kleinen Tropfen (10 bis 50 ul) von Stanz-Lösung auf den Stempel. Es wird über die hydrophile Oberfläche verteilt. Fügen Sie nur soviel Lösung, dass der Rückgang der Stempel deckt, aber nicht über die Kanten laufen. Lassen Protein adsorbieren für 5 Minuten zu stempeln.
- Mit einem Kimwipe ® oder anderen sauberen Papiertuch, Docht aus die meisten der Protein-Lösung aus dem Stempel, ohne die strukturierten Gebiet.
- Trocknen Sie die restliche Lösung aus der Stempel unter einem Strom von sauberen, trockenen, inerten Gas wie Stickstoff.
- Mit Pinzette, entfernen Sie den Stempel aus der Glas-Objektträger, umzukehren, und in Kontakt mit dem gereinigten Deckglas (die Oberfläche strukturiert werden). Legen Sie ein Gewicht auf einen guten Kontakt zu fördern. Das spezifische Gewicht, dass die besten Strukturierung bietet, ist abhängig von den Stempel Größe und Muster; beginnen mit einem 5 g Gewicht und passen zwischen Stanzteile. Lassen Sie Stempel in Kontakt mit der Oberfläche für 1 Minute.
- Vorsichtig zerlegen den Stack und separaten Stempel aus Deckglas.
- Kräftig spülen gemusterten Deckglas in PBS, durch deionisiertes Wasser gefolgt, um Protein, das nicht an der Oberfläche adsorbiert ist zu entfernen. Dry Deckglas unter Stickstoffstrom.
Repräsentative Ergebnisse
Mikrokontaktdruck ist ein leistungsfähiges Verfahren zur Strukturierung Molekülen auf Oberflächen. Dieser Prozess hat die Fähigkeit, Funktionen mit Abmessungen von zehn Mikrometern bis einigen hundert Nanometern zu schaffen; in Abb.. 1A, sind die Logos auf der linken Seite jeweils 200 pm in der Höhe, während die grünen Flecken in Abb. dargestellt. 1B 1 um Durchmesser und Abstand bei 4 um Intervalle, gemessen von Mitte zu Mitte. Abb.. 1B zeigt auch eine leistungsfähige Immobilien Mikrokontaktprägen, nämlich, dass es ist und additiven Prozess. Mehrere Runden von Mikrokontaktdrucken kann eine einzelne Fläche in Mehrkomponenten-Systeme 3 erstellen angewendet werden.
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Discussion
Die Mikrokontaktdrucken Prozess ist konzeptionell einfach und sehr robust, dass die Strukturierung einer Vielzahl von Molekülen auf einer Vielzahl von Substraten aufgebracht. Allerdings bleibt dieser Prozess etwas wie eine Kunst. Die spezielle Geometrie des Musters erstellt werden soll, Eiweiß zu strukturierende, Auflagegewicht und Beschichtung / Stanzen Bedingungen wirken sich auf die Prägequalität. Zum Beispiel, zu wenig Gewicht, auf große Features, führt oft zu Lücken in der Muster wie in der oberen rechten Logo ersichtlich ist. 1A. Umgekehrt, zu viel Gewicht wird ein Durchhängen und dem Zusammenbruch des Stempels verursachen, was zu ungewollten Ablagerung von Protein in Regionen zwischen gemusterten features.As ein zweites Beispiel, spezifische Proteine (zB Antikörper)-Muster mit einer besseren Genauigkeit, wenn der Plasma-Behandlung Schritt ausgelassen wird, Verlassen des PDMS hydrophil. Die Stanzen von Fibronektin auf Glas wird hier als Ausgangspunkt für eine solche Modifikationen und Optimierungen vorgestellt, was die Grundtechniken dieses Prozesses.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasma Cleaner | Harrick Scientific Products, Inc. | PDC-32G | ||
| Desiccator | Nalge Nunc international | 5315-0150 | ||
| PBS | Reagent | Invitrogen | 10010-072 | |
| Protein labeling kit | Reagent | Invitrogen | A30006 | |
| Fibronectin | Reagent | Sigma-Aldrich | F2006 | |
| Staining rack | Reagent | Thomas Scientific | 8542E40 | |
| Coverslips | Reagent | Fisher Scientific | 12-544-12 | |
| Sylgard 184 | Reagent | Ellsworth Adhesives | 184 Sil Elast Kit | |
| Diffraction Grating | Reagent | Edmund Scientific | 3040267 |
References
- Chen, C. S. Geometric control of cell life and death. Science. 276, 1425-1425 (1997).
- Kumar, A., Whitesides, G. M. Features of Gold Having Micrometer to Centimeter Dimensions can be Formed Through a Combination of Stamping with an Elastomeric Stamp and an Alkanethiol "Ink" Followed by Chemical Etching. Applied Physics Letters. 63, 4-4 (1993).
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