Summary
Calcium-Signale eine wichtige Rolle spielen in vielen zellulären Prozessen, einschließlich Genexpression, das Überleben und die Differenzierung. Hier zeigen wir, wie Kalzium-Imaging mit Fura-2 AM durchzuführen. Kalzium-Imaging ist ein wertvolles Werkzeug, um die Regulierung des intrazellulären Calcium in Echtzeit und seiner Regulation von Signalkaskaden zu untersuchen.
Abstract
Calcium-Bildgebung ist eine verbreitete Technik, die nützlich für die Messung Calcium-Signale in kultivierten Zellen ist. Kalzium-Imaging-Techniken nutzen Kalzium-Indikator-Farbstoffe, die BAPTA-basierte organische Moleküle, die ihre spektralen Eigenschaften in Reaktion auf die Bindung von Ca2 +-Ionen zu ändern sind. Calcium Indikatorfarbstoffe fallen in zwei Kategorien, ratio-metrischen Farbstoffe wie Fura-2 und Indo-1 und einer einzigen Wellenlänge Farbstoffe wie Fluo-4. Ratio-metrischen Farbstoffe ändern entweder ihre Anregung oder deren Emissionsspektren in Reaktion auf Calcium, so dass die Konzentration der intrazellulären Kalzium aus dem Verhältnis der Fluoreszenz-Emission oder Absorption bei verschiedenen Wellenlängen ermittelt werden. Der Hauptvorteil der Verwendung von ratio-metrischen Farbstoffe über einzelne Wellenlänge Sonden ist, dass das Verhältnis Signal unabhängig von der Farbstoffkonzentration, Beleuchtungsstärke und optische Weglänge ermöglicht die Konzentration der intrazellulären Calcium-unabhängig von dieser Artefakte zu bestimmen ist. Einer der häufigsten Calcium-Indikatoren ist Fura-2, die ein Emissionsmaximum bei 505 nm und ändert seine Anregung Spitzenwert von 340 nm bis 380 nm wurde als Reaktion auf Calcium-Bindung. Hier beschreiben wir die Verwendung von Fura-2 zur intrazellulären Calcium-Erhöhungen in Neuronen und anderen erregbaren Zellen zu messen.
Protocol
Cell Culture
Die Zellen können gewachsen mit etablierten Techniken hergestellt werden, sondern muss sich auf # 1 Deckgläser mit einem zellulären Selbstklebend (wie Polylysin, Polyornithin oder Laminin) zu den Zellen von Ablösen oder Verschieben während der Bildgebung Experimente zu verhindern beschichtet werden.
Lösungen
Kalzium-Imaging Experimente können mit Hilfe einer Vielzahl von physiologischen Lösungen wie Zellkulturmedien werden. Es ist jedoch wichtig, um sicherzustellen, dass die Lösungen frei von Phenolrot, das erhöht die fluoreszierenden Hintergrund. Wir verwenden Tyrodes Lösung, die leicht gemacht wird und Mimik Liquor, und wir ergänzen sie mit 0,1% Rinderserumalbumin. Wir verwenden Depolarisation mit 60-90 mm Kaliumchlorid Spannung Calciumkanäle und 1 &mgr; Thapsigargin (1 mM Lager in DMSO) oder 2 um Ionomycin (1 mM Lager in DMSO) aktivieren zu speichern betrieben CRAC Kanäle zu aktivieren. Es ist oft zweckmäßig, Calcium aus der extrazellulären Lösung, um zu zeigen, dass Kalzium die Erhöhungen durch die Calcium-Einstrom zu entfernen. Beim Entfernen von Kalzium ist es notwendig, die gesamte Konzentration an zweiwertigen Kationen (Mg 2 + und Ca 2 +) konstant. Pflegen Wird die Behandlung von Kalium für Natrium ist es notwendig, das osmotische Gleichgewicht aufrecht zu erhalten.
Tyrodes Lösungen:
| Niedrige Kalium 2mM Ca 2 + Tyrodes (mM) | Niedrige Kalium 0 CA 2 + Tyrodes (mM) | Hohe Kalium 2mM Ca 2 + Tyrodes (mM) | Hohe Kalium 0 CA 2 + Tyrodes (mM) | |
| NaCl | 129 | 129 | 5 | 5 |
| KCl | 5 | 5 | 129 | 129 |
| CaCl2 | 2 | 0 | 2 | 0 |
| MgCl2 | 1 | 3 | 1 | 3 |
| Glucose | 30 | 30 | 30 | 30 |
| Hepes | 25 | 25 | 25 | 25 |
Der pH-Wert auf 7,4 mit NaOH
Lädt der Fura-2 Calcium-Farbstoff
Wir Wägezellen mit Acetoxy-Methyl-Ester Fura-2 (Fura-2 AM), die durch die Zellmembran diffundiert und ist de-verestert durch zelluläre Esterasen zu Fura-2 freie Säure zu erhalten. Die genauen Parameter für Fura-2 Beladung variieren von Zelltypen. Wir empfehlen, verschiedene Bedingungen durch die Vorbereitung zahlreichen Be-Lösungen, die ein Vielfaches Konzentrationen von Fura-2 tobt 1 bis 4 uM, Inkubation von Zellen in der Be-Lösung für eine Vielzahl von Zeiten zwischen 15 Minuten bis 2 Stunden und Prüfung der Beladung bei Raumtemperatur und bei 37 Grad. Ein vereinfachtes Protokoll für kortikalen Neuronen ist unten angegeben:
- Zuerst bereiten Sie die 1 mM Fura-2 AM Lager, indem 50 ul DMSO zu einer 50 Mikrogramm Fläschchen von Invitrogen erhältlich. Es ist wichtig, trockenem DMSO unter Stickstoff verpackt verwenden und es ist notwendig, um das DMSO mit einer Nadel entfernen durch Punktion des Septums zur Hydratation des DMSO zu verhindern. Nach der Vorbereitung der Fura-2 AM-Lösung halten es in einem dunklen, trockenen Ort. Fura-2 AM in DMSO bei RT stabil für 24 Stunden und ist stabil - 20 Grad in einem trockenen Behältnis für mehrere Monate.
- Aliquot 2 ml Kulturmedium in eine 15 ml konischen Rohr, warm bis 37 Grad. und fügen 2μl von Fura-2 AM Lager zu einer 1 &mgr; Fura-2 AM-Lösung zu generieren. Vortex die Lösung 1 Minute kräftig.
- Übertragen Sie die Be-Lösung für ein 35 mm Gewebe-Kulturschale und übertragen Sie die Deckgläschen mit den Zellen in die Schüssel.
- Inkubieren Sie die Neuronen bei 37 Grad 30 Minuten lang in einem dunklen Brutkasten. Die Zeit der Inkubation genau.
- Bereiten Sie eine 35 mm Schale mit 2 ml Gewebekultur-Medien ohne Fura-2 AM. Entfernen Sie das Deckglas aus dem Laden-Lösung und in der neuen Schale.
- Montieren Sie das Deckglas auf dem Imaging-Kammer. Entfernen Sie das Deckglas aus den 35 mm-Schale und schnell auf den Messschacht stellen, um Austrocknen der Zellen zu verhindern montieren. Wir verwenden ein bildgebendes Kammer von Warner Instruments hergestellt, dass ein 10mm Deckglas mit den Zellen auf dem Boden und ein zweites Deckglas auf der Oberseite bildet ein Sandwich montiert werden gemountet werden können. Die beiden Deckgläser sind mit Vakuum-Fett auf der Kammer und zwei Röhren an beiden Enden der Kammer sicherte damit für die Perfusion der Lösungen durch die Kammer. Die Eingabezeile ist mit einer Spritze verbunden und der Ausgang Linie ist es, eine gut, dass durch eine Saugleitung angeschlossen, um ein Vakuum Falle geleert ist.
Das Mikroskop
Wir verwenden eine umgekehrte Nikon Eclipse TE2000-U-Mikroskop mit einer Xenon-Bogenlampe (Sutter Instruments), ein automatisiertes Stufe (Ludl), einer Anregung Filterrad (Ludl) und einer gekühlten Charge-Coupled Device (CCD)-Kamera (Hamamatsu Orka ausgestattet II). Das Mikroskop wird von einem Macintosh com gesteuertputer läuft Open Lab Software (Improvisation). Mehrere andere Software-Pakete stehen für ratiometrische Bildgebung. Für die Bildgebung verwenden wir 40, 60 oder 100x Nikon Fluor Ölimmersionsobjektive mit einer NA von mehr als 1,2.
Imaging Protocol
- Kalibrieren Sie den Mikroskoptisch.
- Laden Tyrodes Lösung in die Eingabezeile darauf achten, dass die Bildung von Luftblasen zu verhindern.
- Schließen Sie die Kammer auf die Perfusion Linien und perfuse Tyrodes Lösung durch die Kammer wieder, kümmert sich um die Bildung von Luftblasen in der Kammer zu verhindern
- Geben Sie einen Tropfen Öl auf das Ziel, Ort der Kammer auf dem Mikroskoptisch und konzentrieren sich auf die Zellen im Durchlicht.
- Untersuchen Sie die Fluoreszenz der Zellen mit der Beleuchtung bei 340 und bei 380 nm mit der Okulare. Ruhende Zellen sollten dim bei 340 und hell bei 380. Im Allgemeinen sollten die Zellen nicht mit UV-Licht für mehr als 10 oder 15 Sekunden beleuchtet werden und die Intensität des Anregungslichtes sollte mit einem Graufilter zu Phototoxizität verhindern reduziert werden.
- Die Zellen werden mit der Kamera und stellen Sie die Verstärkung und Belichtungszeit der Kamera auf ein Bild, das nahe an der Sättigung (aber nicht gesättigt), wenn bei 380 nm beleuchtet und auch unterhalb der Sättigung, wenn bei 340 nm beleuchtet wird zu generieren. Halten Sie die Exposition unter 200 ms, wenn möglich. Einmal eingestellt, ändern nichts an der Kamera zu gewinnen oder Exposition, es sei denn Sie verändern auch den Hintergrund zu planen, Rmin und Rmax (siehe unten).
- Sammeln Sie ein Bild bei jeder Wellenlänge und nutzen Sie die Region of Interest (ROI)-Tool, um die Intensität der Hintergrund in einer Vielzahl von Orten zu messen in den Bildern für jede Wellenlänge.
- Durchschnittliche Hintergrund Werte und geben Sie den Hintergrund-Werte in die entsprechenden Stellen in der Imaging-Programm. Der Hintergrund Wert wird von jedem Pixel auf dem Gebiet abgezogen werden.
- Sammeln Sie eine Praxis-Verhältnis Bild und stellen Sie die Grenzwerte für jede Wellenlänge ein Verhältnis Bild, dass nur die Zellen und nicht der Hintergrund und das ist nicht in der Region in der Nähe der Ränder der Zellen lauten gehören zu generieren.
- Stellen Sie die minimale Verhältniswert (Rmin) auf etwa 10% unter dem niedrigsten Verhältnis von einer beliebigen Zelle in dem Feld sein.
- Stellen Sie die Rmax etwa 12-fache des Rmin werden. Ändern Sie nicht die Rmin oder Rmax zwischen den Experimenten, dass Sie planen, zu vergleichen, da sie den Vergleich schwierig. Wir selten ändern Rmin und Rmax Werte auf unsere Imaging-rig.
- Verwenden Sie die automatische Bühne, um die Felder, die Sie planen, Bild zu finden, und notieren Sie den Speicherort der einzelnen Felder mit Hilfe der Software. Wir sammeln in der Regel fünf Felder der Blick während eines Experiments. Die automatisierte Bühne bewegt, um ein Feld, sammelt ein Verhältnis Bild und bewegt sich auf das nächste Feld.
- Richten Sie den Zeitraffer-Intervall, um Bilder zwischen 0,1 und 10 Sekunden auseinander, je nach der Art der Signale, die Sie erwarten zu sehen, zu sammeln.
- Starten Sie das Experiment.
- Bei der Prüfung der Kalzium-Imaging-System ist es oft nützlich, auf Reize wie hohe Kalium Tyrodes (65 mM KCl) oder Ionomycin (2 um), die einen intrazellulären Calcium-Anstieg und Kalzium freien extrazellulären Lösung führen wird verwenden, wird (mit dem Kalzium-Puffer wie EGTA und BAPTA ), das reduziert die Calcium-Konzentration.
Analyse
Nachdem das Experiment abgeschlossen ist, wollen die Menge der Ratio-Bildern in Zeitraffer-Kalzium-Messungen konvertieren für einzelne Zellen oder Regionen von Interesse innerhalb der Zellen. Um dies zu tun:
- Verwenden Sie die Region of Interest-Werkzeug (ROI) auf die Bereiche des Bildes, in dem Sie Kalzium Maß zu definieren. Es ist generell nützlich, um mindestens einen ROI, dass die Zellkörper der Zelle abdeckt. Bei der Definition der ROIs, ist es sinnvoll, den Film der Bilder, um sicherzustellen, dass die Zellen nicht im Laufe des Experiments zu bewegen spielen.
- Mit der Software können Zeitraffer-Verhältnis Messungen für jede ROI in jedem Bild zu sammeln.
- Import das Verhältnis Messungen in ein Analyse-Programm. Sie müssen die Calcium-Spuren für bestimmte Zellen oder ROIs, durchschnittlich mehrere Zellen oder ROIs und wandelt das Verhältnis Messungen Calcium-Werte intrazellulär. Wir verwenden eine Reihe von Makros in Igor Pro geschrieben, die uns all diese gemeinsamen Analyse Aufgaben, sondern auch andere Programme wie Excel erlauben, wenn auch weniger komfortabel auch verwendet werden können.
- Die Gleichung [Ca] = (RR min) / (R max-R) Sf * Kd kann der Fura-2-Ratio-Werte zu konvertieren intrazellulären Kalziumkonzentration werden. [Ca] ist der Calcium-Konzentration, R der Fura-2 340/380 Verhältnis ist, sind Rmin und Rmax die 340/380 Verhältnisse in Abwesenheit von Calcium oder in Gegenwart von einer sättigenden Konzentration von Kalzium-bzw. und Sf * Kd ist das Produkt der Kd von Fura-2 (ca. 120 nM bei RT) und einen Skalierungswert. Zur Messung R Min, R Max und Sf * Kd ist es notwendig, entweder eine In-vivo-oder in vitro-Kalibrierung. In-vivo-Kalibrierung erfordert eineKombination von Patch-Clamp-und Kalzium-Imaging, die kompliziert, kann aber auch sehr präzise. In-vitro-Kalibrierung kann mit einem hausgemachten Kalibrierkammer, die aus zwei Deckgläsern mit einer dünnen Deckglas spacer getrennt, um eine dünne Schicht der Lösung, in der die Kalibrierung zu erzeugen besteht. Die bequemste Methode zur Messung der Fura-2-Ratio-Werte als Funktion der Calcium-Konzentrationen ist es, ein Kalibrierungs-Kit, das mehrere gepufferte Calcium-Lösungen und Fura-2 freie Säure enthalten, verwenden. Diese können von Invitrogen (Molecular Probes) erhältlich und enthalten genaue Anweisungen für die Verwendung.
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Discussion
In dieser Präsentation haben wir alle Schritte für die Durchführung von Kalzium-Imaging mit Fura-2 AM gegangen. Wir verwendeten kortikalen Neuronen als Modell, sondern Kalzium-Imaging kann zur intrazellulären Calcium in Echtzeit gemessen in einer Vielzahl von Zellen sein. Wenn Sie dieses Verfahren ist es wichtig, Deckgläser statt Kunststoff zu verwenden, da Kunststoff wird häufig fluoreszierende bei ultravioletten Wellenlängen, die Bildgebung erschwert. Auch ist es wichtig, pre-Beschichtung der Deckgläser mit Polyornithin und Laminin, um Zellen aus Ablösen zu verhindern. Schließlich ist es wichtig, sich daran zu erinnern, damit Sie keine Luftblasen, wenn Perfusion Lösungen durch die Imaging-Kammer.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| New Item | Fura-2 AM | Invitrogen | F1221 | Protect from light |
| New Item | DMSO | Electron Microscopy Sciences | MX1457-6 | Keep in dry place to prevent hydration |
| New Item | Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A8022-100G | Store at 4° |
| New Item | Imaging Chamber | Warner Instruments | Model RC-20H | |
| New Item | Microscope | Nikon Instruments | Eclipse TE2000-U | |
| New Item | Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| New Item | Calibration Kit | Molecular Probes, Life Technologies | F6774 | Protect from light |
References
- Grynkiewicz, A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J. Biol. Chem. 260, 3440-3450 (1985).
- Lewis, Mitogen-induced oscillations of cytosolic Ca2+ and transmembrane Ca2+ current in human leukemic T cells. Cell Regul. 1, 99-112 (1989).
- Dolmetsch, Signaling between intracellular Ca2+ stores and depletion-activated Ca2+ channels generates [Ca2+]i oscillations in T lymphocytes. J Gen Physiol. 103, 365-388 (1994).
