Summary
Photo-induzierte Quervernetzung von unmodifizierten Proteine (picup) ermöglicht die Charakterisierung des Oligomers Größenverteilung in metastabilen Protein-Mischungen. Wir zeigen, Anwendung picup zu drei Vertreter amyloidogene Peptide der 40 - und 42-Rückstand bildet der Amyloid-β-Protein und Calcitonin, und eine Kontrollgruppe Peptid Wachstumshormon-Releasing-Faktor.
Abstract
Die Montage der amyloidogene Proteine in toxischen Oligomere ist ein wegweisendes Ereignis in der Pathogenese der Fehlfaltung Erkrankungen, darunter Alzheimer, Parkinson und Huntington-Krankheit, erblich amyotrophe Lateralsklerose, und Typ 2 Diabetes. Aufgrund der metastabilen Charakter dieser Protein-Baugruppen, ist es schwierig, ihre Oligomer Größenverteilung quantitativ zu erfassen mit klassischen Methoden wie Elektrophorese, Chromatographie, Fluoreszenz oder dynamische Lichtstreuung. Oligomere von amyloidogene Proteine existieren als metastabile Mischungen, in denen die Oligomere in Monomere dissoziieren und assoziieren zu größeren Baugruppen gleichzeitig. Picup stabilisiert Oligomer Populationen durch kovalente Vernetzung und wann mit Fraktionierung Methoden, wie Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) oder Größenausschlusschromatographie (SEC) kombiniert wird, liefert picup Schnappschüsse des Oligomers Größe Distributionen, die vor dem Kreuz gab Vernetzung. Daher ermöglicht picup Visualisierung und quantitativen Analyse von metastabilen Protein Populationen und kann zur Montage und entschlüsseln Beziehungen zwischen Sequenz Modifikationen und Oligomerisierung überwachen
Protocol
1. Peptide Vorbereitung
- Abwiegen ~ 100-200 pg lyophilisierten Peptids unter Verwendung einer Mikrowaage und Transfer in beschriftete, Silizium beschichtet, low-Adsorbens Mikrozentrifugenröhrchen. Hier verwenden wir die menschliche Sequenzen von Aβ40, Aß42, Calcitonin und GRF.
- Hier verwenden wir Peptide mit 1,1,1,3,3,3-Hexafluor-2-propanol (HFIP) vorbehandelt, um eine homogene, Aggregat-freie Präparate zu erhalten. Dieser Schritt ist notwendig, weil vorgeformte Aggregate induzieren schnelle Aggregation von amyloidogenen Proteine, die in schlechten Reproduzierbarkeit unter Versuchen 5 führen. Andere Methoden wie Filtration und SEC können auch verwendet, um Aggregate-freie Präparate für picup 6 erhalten werden.
- Zur Behandlung der Peptide mit HFIP, pre-chill die HFIP Behälter auf Eis in einem Abzug tragen angemessenen Schutz (HFIP ist flüchtig und toxisch). Kühlung von einem 250-ml-Flasche erfordert in der Regel 10-15 min. Add HFIP zu vorgekühlte Röhrchen mit Peptid Lyophilisate zu einem nominalen Peptid-Konzentration von 0,5 mM zu erhalten.
- Beschallen das Peptid-Lösungen in einem Wasser-Ultraschallbad für 5 min bei Raumtemperatur.
- Vortexen und die Röhrchen für 30 min bei Raumtemperatur.
- Gefühlt die Röhrchen auf Eis (für 1 min), und teilen Sie die Lösungen in 10 bis 50-ul-Aliquots in beschrifteten 0,6-ml Low-Adsorbens Rohre.
- Entfernen HFIP durch Verdunstung unter einem leichten Stickstoffstrom, oder lassen Sie die Rohre geöffnet im Abzug über Nacht. Für Übernachtung Verdunstung, statt die offenen Rohre in ein Rack und bedecken sie mit einem großen Blatt Kimwipes, um Staub und Partikel Kontamination zu vermeiden.
- Exsiccate die restlichen HFIP im Vakuum in einem Lyophilisator oder eine Zentrifugenkonzentrator für 30 min, oder in einem Exsikkator befestigt, um ein Vakuum Einlass für 2 h. Das Endprodukt wird ein Peptid Film an der Unterseite des Mikrozentrifugenröhrchen werden. Wenn sie richtig exsiccated, können die Rohre luftdicht über einen längeren Zeitraum (Monate) gelagert werden bei -20 oder -80 ° C.
2. Solubilisierung der HFIP behandelten Peptide und Foto-Vernetzung
- Vor Solubilisierung der HFIP behandelten Peptide für Vernetzungsreaktionen, muss man die Vernetzung und Abschrecken Reagenzien vorzubereiten.
- Abwiegen Ammoniumpersulfat (APS, Herr 228,2 g / mol) und bereiten eine 20 mM Lösung in 10 mM Natriumphosphat, pH 7,4. Mix mit einem Vortex, bis die Lösung klar ist.
- Bereiten Sie 1 mM Lösung von Tris (2,2-Bipyridyl) dichlororuthenium (II)-Hexahydrat (Rubpy, Herr 748,63 g / mol) in 10 mM Natriumphosphat, pH 7,4. Mix mit einem Vortex und überprüfen vollständige Auflösung. Schützen Sie das Rohr von Licht mit Aluminiumfolie.
- Für SDS-PAGE-Analyse nach Quervernetzung, ist eine bequeme Abschrecken Reagenz 5% β-Mercaptoethanol in 2 × SDS-PAGE-Probenpuffer. Alternativ 1 M Dithiothreitol (DTT, Herr 154,5 g / mol) in deionisiertem Wasser oder einem geeigneten Puffer verwendet werden kann.
- HFIP behandelten Peptid Filme werden in verdünnter NaOH zuerst gelöst und dann Natriumphosphatpuffer wird hinzugefügt, um ~ 30 nM Peptid-Konzentration zu bekommen. Add 60 mM NaOH, gefolgt von VE-Wasser in das Rohr mit dem Peptid-Film, so dass NaOH und Wasser 10 und 45% des letzten Bandes bzw. darstellen. Kratzen Sie die Peptid-Film aus den Innenwänden der Mikrozentrifugenröhrchen mit der Spitze, mischen durch Auf-und Abpipettieren und beschallen für 5 min in einem Wasser-Ultraschallbad.
- Fügen Sie 45% 20 mM Natriumphosphat, pH 7,4, durch Pipettieren gründlich mischen und zentrifugieren bei 16.000 g für 10 min. Beiseite Aliquots von unvernetzten Peptide mit dem Abschrecken Reagenz für negative Kontrollen gemischt.
- Stellen Sie die Kamera-Auslöser-Verzögerung bis 1 s. Bei höheren Belichtungszeiten, können umfangreiche radikalen Reaktionen hervorrufen Proteinabbau. Legen Sie die Kamera-Auslöser. Bestrahlung etwas Zeit brauche, um optimierte, wenn Sie die Methode mit einem neuen Protein sein.
- Ein typisches picup Reaktion wird in einem 20 ul Reaktionsvolumen durchgeführt. Transfer-18 ul der Peptid-Lösung in eine dünnwandige, klar, 0,2-ml PCR-Röhrchen.
- Um die Peptid-Lösung geben, 1 ul Rubpy um 1 ul APS gefolgt und mischen Sie die Reagenzien durch Pipettieren (die Endkonzentration Rubpy und APS in der Reaktionsmischung wird 0,05 und 1 mm, bzw. werden).
- Schnell Platz Reaktionsrohr in einem 1,8-ml-Glasflasche. Legen Sie die Flasche in den Balg vor dem Kameragehäuse befestigt. Befestigen Sie den Objektivschutz und drücken Sie den Auslöser, so dass die Probe für 1 s in den Balg bestrahlt wird.
- Nach Probe-Bestrahlung schnell die Flasche aus dem Balg und PCR-Röhrchen aus dem Fläschchen. Schnell wird die Reaktion durch Zugabe von 1 ul DTT oder 10 ul Reduzierung PAGE Probenpuffer. Wiederholen Sie die Reaktion für jedes Peptid Aliquot.
- Die Reaktionsgemische können nun bei -20 ° C für die Lagerung werden nicht länger als 7 Tage oder auf Eis gehalten vor der Analyse durch SDS-PAGE und Silberfärbung eingefroren.
3. SDS-PAGE und Splitter-Färbungaus vernetztem Peptid-Produkte
- Routine SDS-PAGE und Silberfärbung werden durchgeführt, um vernetzte Peptide zu visualisieren.
- Legen Sie 5 ul der Reaktionsmischung pro Bahn um ~ 130 pmol Peptid pro Bahn zu erhalten.
- Fügen Sie ähnliche Mengen an unvernetzten Peptide für den Vergleich. Auch eine Standard-Protein-Leiter für visuelle Annäherung mit einem Molekulargewicht von Peptid-Bands.
- Führen Sie das Gel mit einem Standard-Gel-Elektrophorese-Apparatur. Wir nutzen die XCell SureLock Mini-Cell-System von Invitrogen und führen Silber-Färbung nach Invitrogen Veröffentlichung IM-1002, Novex Pre-Cast-Gel-Elektrophorese Guide.
Teil 4: Repräsentative Ergebnisse (Abb. 1)
Abbildung 1: Silber-gefärbten Polyacrylamidgelen zeigt unvernetzten (-) und Foto-cross-linked (+) GRF, Calcitonin, Aβ40 und Aß42
SDS-PAGE und Silberfärbung analysiert der picup-generated Aβ40-Oligomere zeigen etwa gleiche Bandenintensität von Monomer durch Tetramer, durch einen starken Rückgang in der Fülle der höheren Oligomeren 7 an. Unvernetzte Aβ40 wandert mit einem Herrn im Einklang mit der Monomer 7. Aß42 zeigt eine deutliche Oligomer Größenverteilung. Aß42 Oligomeren umfassen 2-3 Gruppen 8. Die erste Gruppe, Monomer durch Trimer zeigt abnehmender Intensität mit zunehmender Oligomer bestellen. In der zweiten Gruppe, ist ein Gaussian-like Verteilung zwischen Tetramer und Heptamer beobachtet, mit einem Maximum bei Pentamer und Hexamer. Die dritte Gruppe, die hier nicht dargestellt ist, enthält Oligomere von Herrn ~ 30.000-60.000 Da 8. Diese höheren Herrn Oligomere typischerweise beobachtet mit SEC-isolierter LMW Aß42 aber nicht Peptid durch Filtration oder HFIP Behandlung 6 hergestellt. Unvernetzte Aß42 produziert vorwiegend zwei Bands, ein Monomer-Band und einem breiten Trimer / Tetramer Band, die ein Artefakt durch SDS 5,9 induziert wird. Calcitonin ergibt sich ein Oligomer Größenverteilung, die stark abweicht von einem monotonen exponentielle Abnahme in der Region Monomer durch Tetramer, was darauf hindeutet Präexistenz Dimeren, Trimeren und Tetrameren 7. Die Steuerung Polypeptid, GRF, produziert eine monotone Oligomerverteilung von Dimer durch Hexamer, so dass die scheinbare relative Mengen an Oligomeren exponentiell mit zunehmender Molekülmasse. In anderen Experimenten, höhere Oligomere könnten auch visualisiert 7 sein. Die genaue Anzahl und relativen Intensitäten der Oligomer Bands können etwas variieren zwischen Experimente abhängig von der tatsächlichen Protein-Konzentration, die Menge an Protein auf das Gel aufgetragen, und die Zeit für die Entwicklung Schritt in die Silber-Färbung Protokoll verwendet.
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Discussion
Picup war ursprünglich eine stabile Protein-Komplexe 2-Studie entwickelt. Die Methode wurde später auf quantitative Studie von metastabilen Amyloid-Protein-Baugruppen, darunter Aß 10, Prionen und krankheits-assoziierte PrP Sc 11 und α-Synuclein 12 aufgebracht. Die wichtigsten Faktoren, die bei der Gestaltung eines picup Experiment werden müssen, sind das Reagenz Stöchiometrie, Bestrahlungszeit und Probenvorbereitung. Die ersten beiden Probleme erfordern empirische Optimierung, während die letztgenannte Frage weitgehend beeinflußt die Interpretation der experimentellen Daten. Für amyloidogenen Proteinen erfordert insbesondere die Bestimmung der Größenverteilung von metastabilen Oligomere mit aggregierten-free Startvorbereitungen. Der Hintergrund, Mechanik, Instrumentierung wurden, Protokoll-Optimierung, Umfang, Modifikationen, Anwendungen und Grenzen der picup in früheren Publikationen 1,2,13 abgedeckt. Picup lassen sich stabile, lösliches Protein-Oligomere zu erzeugen, dass nach Fraktionierung und Reinigung, könnte für strukturelle Studien, Zytotoxizitätsassays, Oligomerisierung-Hemmung Studien und als Ziele für die Entwicklung von molekularen Erkennung Werkzeuge verwendet werden können.
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Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse AG027818 und AG030709 von NIH / NIA, 2005/2E aus dem Larry L. Hillblom Foundation, IIRG-07-58334 vom Alzheimer Association und 07-65798 vom California Department of Public Health unterstützt.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Dolan-Jenner 200-W incandescent lamp | Other | Dolan-Jenner Industries | Model 170-D | The heat generated by the lamp d–s not affect samples for short incubation periods. |
| 35-mm SLR camera body | Tool | Pentax | SP500 model | In our settings, a bellows is attached to the body of the camera to provide a convenient chamber for irradiation of the sample placed 10 cm away from the light source. |
| Clear, thin walled PCR tubes | Other | Eppendorf | 951010006 supplied by Fisher L22-003-24 | |
| Glass vials (1.8 mL) | Other | Kimble Chase | 60940A 2, supplied by Fisher 03-340-60 | |
| GRF | Reagent | Bachem | H-3695 | |
| HFIP | Reagent | TCI America | H0424 | Use in a fume hood. |
| Aβ40 and Aβ42 | Reagent | UCLA Biopolymers Laboratory | ||
| Calcitonin | Reagent | American Peptide | 22-1-10 | |
| Tris(2,2-bipridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate | Reagent | Sigma-Aldrich | 224758-1G | Vortex until the solution is clear. Cover the RuBpy tube with foil to protect the reagent from ambient light. RuBpy is prepared freshly each time and should be used within 48 h. |
| Ammonium persulfate | Reagent | Sigma-Aldrich | A-7460 | Vortex until the solution is clear. APS is prepared freshly each time and should be used within 48 h. |
| β-mercapt–thanol | Reagent | Sigma-Aldrich | M7154-25 ML | Can be used when SDS-PAGE analysis is performed. |
| Novex Tricine SDS Sample Buffer (2x) | Reagent | Invitrogen | LC1676 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | Tool | Invitrogen | EI0001 | |
| Novex Tricine Gels (10-20%) | Other | Invitrogen | EC6625B0X | |
| Novex Tricine SDS Running Buffer (10x ) | Invitrogen | LC1675 | ||
| Silver Express Staining Kit | Invitrogen | LC6100 |
References
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