Summary
जटिल हरकत में व्यवहार का अध्ययन
Abstract
मक्खियों जटिल आनुवंशिक इस क्षेत्र में शोधकर्ताओं के लिए उपलब्ध उपकरणों की अधिकता के कारण व्यवहार का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल उपलब्ध कराते हैं. में हरकत का व्यवहार अध्ययन
Protocol
भाग 1: दूध पिलाने की और मक्खियों के प्रबंधन
- मक्खियों खमीर मुक्त मानक मीडिया युक्त बोतलों में विकसित किया जाना चाहिए. आप मक्खियों की बड़ी संख्या की आवश्यकता है, तो पार करने के लिए सेट किया जा तदनुसार की जरूरत है. 25 º सी. पर अंधेरे: चक्र मक्खियों एक 12 घंटे प्रकाश में हो जाना चाहिए
- मक्खियों eclosion के बाद जल्द ही एकत्र किया जाना चाहिए (1-3 दिन). मक्खियों इस मंच का उपयोग एक कार्बन डाइऑक्साइड विसारक के साथ काम किया जा सकता है, और परीक्षण autoclaved या खमीर मुक्त मीडिया युक्त ट्यूबों में हल किया जाना चाहिए. हम एक टेस्ट ट्यूब में केवल संग्रहीत, पुरुषों 10 का उपयोग करें.
- कार्बन डाइऑक्साइड के उपयोग के बाद व्यवहार प्रयोगों को चलाने से पहले कम से कम एक या दो दिन की अनुमति दें. हम हमारे व्यवहार परख में ECLOSION निम्नलिखित 3-5 दिनों मक्खियों चलाने.
- Assays हमेशा एक ही 2-3 घंटे का समय खिड़की के प्रत्येक दिन के भीतर किया जाना चाहिए circadian ताल के मुद्दों से बचने के.
भाग 2: एक नियंत्रित वातावरण में ट्रैकिंग प्रणाली की स्थापना
- सभी प्रयोगों जो 70% आर्द्रता के साथ 25 º सी के एक निरंतर तापमान बनाए रखता है एक वातावरण कमरे में किया जाता है.
- क्षेत्र भर में एक डिजिटल वीडियो कैमरा (कैमरे अधोमुख) दर्ज किया जा निलंबित. चूंकि हमारे ट्रैकिंग सॉफ़्टवेयर के विपरीत आधारित है, हम एक प्रकाश बॉक्स पर कैमरे स्थगित. कैमरा रिकॉर्ड वीडियो सीधे एक FireWire कनेक्शन के माध्यम से एक Dell कंप्यूटर पर. हम एक तीव्र डिजिटल वीडियो कैमरा, वीडियो अधिग्रहण के लिए Windows चलचित्र करनेवाला के साथ एक Dell कंप्यूटर के लिए कांटे की शकल (Vista संस्करण) का उपयोग करें.
- एयर दालों इस प्रोटोकॉल में प्रशासित किया जाएगा, तो हवा का प्रवाह के लिए एक स्रोत के कमरे में मौजूद होना चाहिए. रबर टयूबिंग का प्रयोग, हवा निस्पंदन के लिए एक कार्बन फिल्टर हवा स्रोत से कनेक्ट.
- अधिक रबर टयूबिंग का उपयोग, एक खोखले रबर डाट के माध्यम से एक फ्लास्क Erlenmeyer कार्बन फिल्टर के दूसरी तरफ से कनेक्ट, और के बारे में पानी की एक आधा इंच के साथ फ्लास्क भरने. यह हवा गीला जाएगा.
- फ्लास्क भी एक sidearm है, जो रबर टयूबिंग के माध्यम से एक वाई के आकार का वाल्व से कनेक्ट करेगा होना चाहिए.
- वाई वाल्व की एक शाखा एक flowmeter से जुड़ा होना चाहिए. अन्य शाखा हवा वर्ग हरकत चैम्बर के लिए वितरित करना चाहिए.
भाग 3: हरकत चैम्बर के लिए मक्खियों वितरित
- वर्ग हरकत कक्ष वुल्फ एट अल से डिजाइन पर आधारित है +२००२ 1. छोटी सी बूंद ट्रे के अलावा कक्ष के भीतर उड़ान से मक्खियों को रोकने के साथ . कक्ष के अलावा लिया होना चाहिए, और सभी घटकों को अच्छी तरह से 70% इथेनॉल के साथ किया जाना चाहिए नीचे सफाया और उपयोग करने से पहले सूखे.
- तुरंत एक व्यवहार परख आयोजित के पहले संज्ञाहरण संभावित प्रदर्शन समझौता कर सकते हैं. इस से बचने के लिए, मक्खियों धीरे एक छोटी सी दुकान के साथ एक कक्ष का उपयोग कर कीप में दस्तक दी हैं. सही आकार की एक दुकान बनाने के लिए, एक चिमनी के अंत तक एक नीले विंदुक टिप (P1000 के लिए) संलग्न. कैंची का प्रयोग करें के लिए रवाना विंदुक टिप के बहुत अंत में कटौती करने के लिए खोलने के माध्यम से पारित करने के लिए एक मक्खी के लिए काफी बड़ा बनाने के लिए.
- हमारे चैम्बर के शीर्ष plexiglass के एक छोटे से टुकड़े के किनारों के आसपास शिकंजा द्वारा सुरक्षित है. जब शिकंजा हटा रहे हैं, छेद करने के लिए चैम्बर में मक्खियों को वितरित किया जा सकता है. Plexiglass शीर्ष स्थान ताकि पेंच छेद भीतरी कक्ष पर सीधे के बजाय जहां एक पेंच सामान्य बैठता बैठता है. एक परीक्षण मक्खियों युक्त ट्यूब ले लो और यह कीप, जो तब पेंच छेद में रखा जाना चाहिए पर उल्टा जगह.
- कीप ले जाने के, के रूप में इस चोट या मक्खियों को नुकसान पहुंचा सकता है नहीं है. इसके बजाय, धीरे पूरे चैम्बर धमाका, कीप और सभी, जब तक सभी मक्खियों कक्ष के अंदर हैं. इस पिटाई के सदमे को अवशोषित यह दस्तक एक माउस पैड पर किया जाना चाहिए. जब मक्खियों के अंदर हैं, कीप निकालने के लिए, और फिर स्थिति पेंच बेड पर plexiglass शीर्ष. तब फिर पेंच जगह में plexiglass शीर्ष.
भाग 4: लोकोमोटर परख रनिंग
- एक बार मक्खियों ठीक से लोड कर रहे हैं, उन्हें 30 मिनट के लिए चैम्बर में acclimate. इस acclimation नियंत्रित वातावरण (25 º सी, 70% आर्द्रता) की अवधि में जगह ले, और चाहिए चैम्बर प्रकाश बॉक्स के शीर्ष पर रखा जाना चाहिए (जो चालू होना चाहिए). दूसरे कमरे लाइट बंद.
- Acclimation अवधि के बाद, वायु प्रवाह प्रणाली ऐसी है कि हवा केवल flowmeter बहेगा में वाई - वाल्व स्विच. हवा पर मुड़ें, और हवा वांछित गति (4.0-6.0 एल / मिनट) के लिए रैंप. हम आम तौर पर 5.0-5.5 एल / मिनट, लेकिन उस श्रेणी में किसी भी गति से काम करेगा का उपयोग करें.
- एक बार इच्छित airspeed उपलब्ध हो जाता है, वाई वाल्व स्विच हरकत चैम्बर के लिए इतना है कि हवा बहती है. समय 15 सेकंड के लिए इस हवा नाड़ी, और फिर अचानक हवा बंद. जैसा कि आप हवा बंद, कैमरा स्विच मोड को रिकॉर्ड करने के लिए. (यह हिस्सा अभ्यास लेता है एक ही बार में सभी).
- वांछित समय के बाद रिकॉर्डिंग बंद करो और सहेजें. हम प्रति सेकंड 10 तख्ते (जीनोटाइप प्रति कम से कम 8 परीक्षणों) में 30 दूसरा परीक्षण रिकॉर्ड.
भाग 5: वीडियो का विश्लेषण
- हम का उपयोग करेंगतिशील छवि विश्लेषण प्रणाली (DIAS) 2 ट्रैकिंग गति के लिए 3.2 सॉफ्टवेयर . आदेश में इस सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए, हम पहले 7.5.5 क्विकटाइम के साथ एक AVI फ़ाइल स्वरूप के लिए हमारे वीडियो कन्वर्ट.
- इसके विपरीत के आधार पर मक्खियों को ट्रैक करने के लिए, हम समारोह "थ्रेसहोल्ड द्वारा Autotrace" का उपयोग करें. हम तो समारोह "ट्रेस से पथ बनाओ" digitize इन निशान के लिए उपयोग.
- प्रत्येक मक्खी की तात्कालिक गति का उत्पादन करने के लिए, हम "कंप्यूट पैरामीटर" समारोह का उपयोग करने के लिए एक डेटाबेस फ़ाइल का उत्पादन (DIAS विशिष्ट). इस समारोह का उपयोग करना, हम भी एक "5,15,60,15,5" Tukey चौरसाई विंडो का उपयोग कर डेटा चिकनी.
- एक बार इस जानकारी का एक डेटाबेस फ़ाइल के रूप में outputted है, यह Microsoft Excel में खोला जा सकता है. हम एक Matlab स्क्रिप्ट का उपयोग करने के लिए उत्कृष्टता के भीतर तात्कालिक गति संकलन और अतिरिक्त आंदोलन की गतिशीलता और मुक्केबाज़ी संरचना को समझने के लिए आवश्यक मापदंडों की गणना.
प्रतिनिधि परिणाम:
चित्रा 1 जंगली प्रकार एस गुआंगज़ौ जीवों (चित्रा 1, बाएं पैनल) से प्रतिनिधि निशान से पता चलता है और dCASK जीन है जो दो बड़े अतिव्यापी विलोपन (df (3R) x307 और df (3R) x313) (चित्रा 1 के पार द्वारा उत्पन्न किया गया के लिए अशक्त मक्खियों दाएं) पैनल dCASK अशक्त मक्खियों पहले से हरकत Buridan 3 प्रतिमान का उपयोग कर समस्या है दिखाया गया है, और हमारे प्रतिमान में गुआंगज़ौ एस की तुलना में, वे बहुत हरकत कमी आई दिखाने. हम हमेशा जंगली प्रकार जीवों पहले चलाने के लिए यकीन है कि स्थितियों और व्यवहार किसी दिए गए दिन पर सामान्य श्रेणी के भीतर हैं. हम परीक्षण दिनों की कम से कम 5% में प्रतिक्रियाओं से मानक विचलन मनाया है. इन मतभेदों को आम तौर पर हमारे नियंत्रित वातावरण के मापदंडों के साथ समस्याओं के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है.
चित्रा 1 DIAS उत्पन्न दोनों एस गुआंगज़ौ जंगली प्रकार (बाएं) मक्खियों और लोकोमोटर की कमी dCASK अशक्त मक्खियों अतिव्यापी विलोपन (ऊपर सही) से उत्पन्न के निशान निशान का प्रतिनिधित्व करते हैं क्या दर्ज वीडियो में देखा है. 8-10 मक्खियों से दोनों चित्रों contrain निशान वीडियो ट्रैकिंग परख में 30 सेकंड के लिए एक हवा नाड़ी के बाद चलाने के.
चित्रा 2 वन्य प्रकार मक्खियों एक हवा पल्स (बैंगनी सलाखों) के बाद हरकत परख (ऊपर) और एक हवाई पल्स (नीला) के बिना चला गया .. सभी पैरामीटर विश्लेषण प्रोग्राम द्वारा गणना में, वहाँ दो स्थितियों के बीच कोई महत्वपूर्ण मतभेद (दो - पुच्छ t परीक्षण छात्र के साथ निर्धारित) थे. यह दर्शाता है कि एक हवाई नाड़ी के बाद, locomote हमारे सेटअप में सामान्य रूप से मक्खियों.
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Discussion
हमारे सेटअप में, एक मामूली मजबूत हवा पल्स transiently मक्खी आंदोलन बंद हो जाता है. जब हवा पल्स समाप्त होता है, मक्खियों इस स्थिर राज्य और सामान्य locomote से जारी किया जाता है, के रूप में आंकड़ा 2 में दिखाया गया है. क्योंकि यह हवा पल्स प्रभावी रूप से जनसंख्या के हरकत सिंक्रनाइज़, हम इसे उपयोग करने के लिए परीक्षण शुरू इतना है कि हम भी एक गति को तोड़ने उत्तेजना के बाद आंदोलन की शुरुआत का अध्ययन कर सकते हैं. परख, तथापि, एक हवा नाड़ी के बिना कर सकते हैं किया जा के बाद से दीक्षा निम्नलिखित हरकत मापदंडों हवा पल्स (चित्रा 2) से अप्रभावित रहे हैं.
एक आने वाली हरकत की स्वचालित विश्लेषण के साथ देखा समस्या collisions का मुद्दा है. ट्रैकिंग कार्यक्रमों के सबसे कुख्यात मक्खियों कि टकराने के साथ निपटने पर बुरा भाग के लिए कर रहे हैं. इन प्रोग्रामों को अक्सर एक वस्तु का "नज़र" क्षण भर के एक टक्कर के दौरान, खोने के लिए और एक नया ऑब्जेक्ट के रूप में इस वस्तु लेबल यह ढूँढने पर. परिणाम एक आउटपुट है कि कई और अधिक पता लगाया की तुलना में वास्तव में कक्ष में मौजूद वस्तुओं जा सकता है. कई लोगों को एकल मक्खियों अनुरेखण के द्वारा इस समस्या को हल. इस के साथ स्पष्ट समस्या है, तथापि, कि एक मक्खी ड्रोसोफिला व्यवहार और चार हरकत में सामाजिक cues की भूमिका के कारण आबादी के व्यवहार की तुलना में बहुत अलग व्यवहार किया जा सकता है . बेशक यह जरूरी है, एक बुरी बात नहीं तुम क्या अध्ययन करने के लिए कोशिश कर रहे हैं पर निर्भर करता है, लेकिन हमारे प्रयोजनों के लिए, हम मक्खियों की आबादी का उपयोग करने के लिए हमारी सांख्यिकीय शक्ति में वृद्धि करना पसंद करते हैं. इस वजह से, हम दो मायनों में collisions के साथ सौदा. सबसे पहले, हम केवल परीक्षण प्रति 8-10 मक्खियों (हमारे 56 मिमी वर्ग कक्ष में) का उपयोग करें, इसलिए कि collisions कम हो जाएगा. दूसरा, हमारे तीस दूसरा परीक्षण के भीतर, हम केवल निशान है कि लंबाई में कम से कम 18 सेकंड कर रहे हैं का विश्लेषण. ऐसा करके, हम हमेशा अपनी संपूर्णता में गति की कई bouts पर कब्जा करने के लिए पर्याप्त समय की रिकॉर्डिंग कर रहे हैं. यह भी सुनिश्चित करता है कि हमारे नमूना आकार हमेशा एक कक्ष में मक्खियों की संख्या को दर्शाता है, गति के छोटे टुकड़ों के रूप में खारिज कर रहे हैं और वीडियो की कुल लंबाई केवल 30 सेकंड है.
डेटा विश्लेषण इस पूरी प्रक्रिया का सबसे कठिन हिस्सा हो सकता है है. ट्रैकिंग डेटा का विश्लेषण करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम के शोर और गति के बीच अंतर को निर्धारित है. DIAS (कई अन्य कार्यक्रमों की तरह) लगभग कभी नहीं 0 मिमी / गति का उत्पादन होगा, भले ही मक्खी चलती बंद कर दिया है. इस वजह से, यह महत्वपूर्ण है जबकि फ्रेम से डेटा निर्गम फ्रेम करने के लिए देखने के लिए जब जीवों गति में वास्तव में कर रहे हैं पर देख वीडियो देखने के लिए, और जब वे नहीं कर रहे हैं. हमारे सेटअप में, 1 मिमी / s नीचे सभी गति शोर है, जो अन्य समूहों का उपयोग DIAS वयस्क 1 मक्खियों के साथ क्या पाया है के साथ संगत है लग रहे हो . मुक्केबाज़ी संरचना की गतिशीलता को देख के लिए, एक भी एक मुक्केबाज़ी को परिभाषित करने के लिए की जरूरत है. हम 3 या उससे अधिक 1 मिमी / एस ऊपर की गति लगातार फ्रेम, और निष्क्रियता के रूप में इस सीमा से नीचे 3 या उससे अधिक लगातार फ्रेम के रूप में गतिविधि को परिभाषित.
डेटा भी ठीक से क्षणिक प्रकाश चंचल और कैमरा विकृतियों, जो कभी - कभी होते से कलाकृतियों को खत्म करने चाहिए smoothed हो. डेटा चौरसाई के लिए कोई मानक विधि है, लेकिन यह महत्वपूर्ण है कि चौरसाई प्रक्रिया डेटा की सामान्य प्रवृत्ति भी काफी परिवर्तन नहीं करता है, या एक चौरसाई कलाकृतियों उत्पन्न कर सकते हैं. हम दो बार "5,15,60,15,5" का एक Tukey खिड़की के साथ चिकनी, क्योंकि यह किसी भी बड़े कूदता है या गति में परिवर्तन है कि स्पष्ट रूप से गलत कर रहे हैं को खत्म करने लगता है, लेकिन समग्र या डेटा की प्रवृत्ति प्रकृति को बदल नहीं है.
यह महत्वपूर्ण है पहचान करने के लिए है कि अलग setups और वातावरण अलग व्यवहार परिणामों का उत्पादन होगा. इन मुद्दों के सभी के साथ प्रयोग करने के लिए किसी एक ट्रैकिंग परख की स्थापना के लिए हमारी सिफारिश है जब तक आप एक विधि है जो डेटा कि मैच नेत्रहीन देखा जा सकता है, और तब के रूप में एक ही तरीके से सभी डेटा के उपचार में संभव के रूप में लगातार हो पाते.
सही ट्रैकिंग प्रोग्राम का चयन भी महत्वपूर्ण है. हालांकि हम 3.2 DIAS (www.solltechnologies.com) का उपयोग करें, यह नहीं सबसे अच्छा है या केवल प्रणाली उपलब्ध मतलब है. एकल मक्खियों की ट्रैकिंग के लिए, दान Valente (मित्रा लैब, CSHL) एक Ftrack कार्यक्रम बुलाया विकसित की है. कई मक्खियों साथ locomoting (यानी, जहां collisions से उत्पन्न हो सकती है) के लिए, क्रिस्टिन Branson (Dickinson / Perona लैब्स, कैलटेक) एक Ctrax कार्यक्रम बुलाया विकसित की है. Ftrack www.chronux.org पर उपलब्ध है, जबकि Ctrax www.dickinson.caltech.edu / / अनुसंधान Mtrax पर उपलब्ध है. Ethovision सॉफ्टवेयर (Noldus नीदरलैंड) दोनों एकल और एकाधिक मक्खियों के वीडियो पर नज़र रखने के लिए एक और शक्तिशाली विकल्प उपलब्ध है, लेकिन यह केवल व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है, और काफी महंगा है.
यदि आप एक ट्रैकिंग परख निर्धारित किया है और विश्वसनीय रिकॉर्डिंग प्राप्त नहीं कर सकते हैं, वहाँ कुछ बातों पर विचार कर रहे हैं. Circadian ताल मुद्दों पर अक्सर एक बड़ी समस्या हैं. जब व्यवहार assays के चल रहे हैं, एक हमेशा अपने दोपहर siesta दौरान मक्खियों को नहीं चलाने के लिए सुनिश्चित करना चाहिए. चूंकि हम curre रहे हैंntly जीन है कि हरकत व्यवहार में घट जाती है उत्पादन कर सकते हैं में रुचि रखते हैं, हम देर से दोपहर गतिविधि चोटी (8-10 ZT) के पास मक्खियों को चलाने के लिए पसंद करते हैं. एक अन्य समस्या यह भी स्रोत से असंगत वायु प्रवाह से पैदा कर सकते हैं. शुरू परीक्षण से पहले, flowmeter के साथ वायु प्रवाह का परीक्षण करने के लिए, इसलिए है कि यह बहुत 15 सेकंड हवा पल्स में नहीं उतार चढ़ाव हो जाएगा करने के लिए सुनिश्चित हो. अन्त में, आनुवंशिक पृष्ठभूमि व्यवहार सभी कार्यों में एक भूमिका निभाते हैं, तो कर सकते हैं इस परख के मापदंडों में से कुछ के लिए एक विशेष पृष्ठभूमि के लिए अनुकूलित किया जा आवश्यकता हो सकती है.
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Acknowledgments
इस काम के द्वारा समर्थित राष्ट्रीय संस्थानों स्वास्थ्य अनुदान GM54408 R01 के नियंत्रण रेखा ग्रिफ़िथ के लिए सम्मानित किया गया था. हम हमारे वर्ग कक्ष डिजाइन और हमारे चैम्बर का निर्माण, और दान Valente और विश्लेषण मुद्दों के बारे में उपयोगी बातचीत के लिए टिम Lebestky के लिए ब्राण्डैस विश्वविद्यालय मशीन की दुकान पर हमारी परख, फ्रैंक मेलो की स्थापना में उनकी मदद के लिए फ्रेड वुल्फ धन्यवाद देना चाहूंगा.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Square Chamber | Tool | Machine Shop | N/A | Design from Wolf et al. 20021 |
| Digital Camera | Camera | Sharp | ViewcamZ VL-23 | |
| Flowmeter | Tool | Cole-Parmer | SY-32003-12 | |
| Light Box | Tool | DNASTAR | Seq-Easy | |
| Charcoal Filter | Tool | Fisher Scientific | 09-744-37 | |
| DIAS 3.2 | Software | Soll technologies | N/A | www.solltechnologies.com |
References
- Wolf, F. W., Rodan, A. R., Tsai, L. T. High-Resolution Analysis of Ethanol-Induced Locomotor Stimulation in Drosophila. J Neurosci. 22 (24), 11035-11044 (2002).
- Soll, D. R. The use of computers in understanding how animal cells crawl. International review of cytology. 163, 43-104 (1995).
- Martin, J. R., Ollo, R. A new Drosophila Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase (Caki) is localized in the central nervous system and implicated in walking speed. The EMBO journal. 15 (8), 1865-1876 (1996).
- Levine, J. D., Funes, P., Dowse, H. B. Resetting the Circadian Clock by Social Experience in Drosophila melanogaster. Science. 298, 2010-2012 (2002).
