Hochauflösendes Video Tracking von Locomotion in Adult Drosophila melanogaster

Summary

Die Untersuchung der komplexen Bewegungsapparat Verhalten in

Abstract

Fliegen ein wichtiges Modell für die Untersuchung komplexer Verhalten aufgrund der Vielzahl von genetischen Werkzeugen zur Verfügung, um Forscher in diesem Bereich. Studieren Bewegungsapparates Verhalten in

Protocol

Teil 1: Fütterung und Management von Fliegen

1. Fliegen sollte in Flaschen mit hefefrei gängigen Medien kultiviert werden. Sie benötigen eine große Zahl von Fliegen, so kreuzt müssen entsprechend eingestellt werden. Dunkel-Zyklus bei 25 º C: Fliegen sollte in einem 12-Stunden-Licht angebaut werden
2. Fliegen sollte bald nach eclosion gesammelt werden (1-3 Tage). Fliegen können mit in dieser Phase mit einem Kohlendioxid-Diffusor gearbeitet werden, und sollte in Reagenzgläser mit autoklaviert oder Hefe-freien Medien sortiert werden. Wir verwenden nur bei Männern, gespeichert 10 bis ein Reagenzglas.
3. Planen Sie mindestens ein oder zwei Tage nach der Verwendung von Kohlendioxid, bevor Sie die Verhaltensexperimente. Wir betreiben fliegt in unsere Verhaltensweisen Assay 3-5 Tage nach ECLOSION.
4. Assays sollte immer in der gleichen 2-3 Stunden Zeitfenster pro Tag durchgeführt werden, um zirkadianen Rhythmus zu vermeiden.

Teil 2: Einrichten der Tracking-System in einer kontrollierten Umgebung

1. Alle Experimente werden in einer Umgebung, Zimmer, die eine konstante Temperatur von 25 º C mit 70% Luftfeuchtigkeit gewahrt bleibt.
2. Suspend einer digitalen Videokamera über das Gebiet zu erfassen (Kamera nach unten) sein. Da unser Tracking-Software ist hingegen basiert, auszusetzen wir die Kamera über einen Licht-Box. Die Kamera zeichnet Videos direkt auf einem Dell-Computer über eine FireWire-Verbindung. Wir verwenden ein Sharp digitale Videokamera, bis zu einem Dell-Computer mit Windows Moviemaker angeschlossen (Vista-Version) für Video-Akquisition.
3. Air Impulse in diesem Protokoll wird verabreicht werden, so eine Quelle für den Luftstrom vorhanden sein muss in den Raum. Mit Gummi-Schlauch, verbinden die Luft Quelle zu einem Kohlefilter für Luftreinhaltung.
4. Mit mehr Gummischlauch, verbinden Sie die andere Seite der Aktivkohlefilter in einen Erlenmeyerkolben über eine hohle Gummistopfen, und füllen Sie die Flasche mit etwa einem halben Zentimeter Wasser. Dies wird zu befeuchten die Luft.
5. Der Kolben sollte auch eine Waffe, die zu einer Y-förmigen Ventil über Gummischlauch verbindet.
6. Ein Zweig der Y-Ventil sollte ein Durchflussmesser angeschlossen werden. Der andere Zweig sollte die Luft auf den Platz Fortbewegung Kammer zu liefern.

Teil 3: Delivering fliegt in die Fortbewegung Kammer

1. Der Platz Fortbewegung Kammer ist auf die Gestaltung von Wolf et al. 2002 ^1, mit der Zugabe von kleinen Tropfen Schalen, um die Fliegen vom Fliegen in der Kammer zu verhindern. Die Kammer sollte auseinander genommen werden, und alle Komponenten gründlich abgewischt werden mit 70% Ethanol und getrocknet, bevor verwenden.
2. Anästhesie unmittelbar vor der Durchführung einer Verhaltens-Test kann potenziell kompromisslose Leistung. Um dies zu vermeiden, sind Fliegen sanft in die Kammer mit einem Trichter mit einem kleinen Auslauf klopfte. Um eine Steckdose mit der richtigen Größe, legen einen blauen Pipettenspitze (für P1000) bis zum Ende eines Trichters. Mit einer Schere abzuschneiden ganz am Ende der Pipettenspitze, um die Öffnung groß genug für eine Fliege passieren.
3. Die Spitze unserer Kammer ist ein kleines Stück Plexiglas mittels Schrauben an den Rändern befestigt. Wenn die Schrauben entfernt werden, können die Löcher eingesetzt, um Fliegen in die Kammer zu liefern. Positionieren Sie den Plexiglas oben, so dass das Schraubenloch direkt sitzt über der inneren Kammer statt, wo eine Schraube in der Regel sitzt. Nehmen Sie ein Reagenzglas mit dem Fliegen und legen Sie sie kopfüber in den Trichter, die dann in das Schraubenloch platziert werden soll.
4. Bewegen Sie den Trichter, da dies zu verletzen oder Schäden die Fliegen. Stattdessen sanft bang die ganze Kammer, Trichter und alle, bis alle Fliegen in der Kammer sind. Das Klopfen sollte auf einem Mousepad getan werden, um den Schock dieses Klopfen zu absorbieren. Wenn Fliegen drin sind, entfernen Sie den Trichter, und eine neue Position der Plexiglas-top über die Schraube Betten. Dann wieder schrauben Sie die Plexiglas oben einrasten.

Teil 4: Ausführen des Bewegungsapparates Assay

1. Sobald die Fliegen richtig geladen sind, sollen sie in die Kammer für 30 Minuten akklimatisieren. Diese Eingewöhnungszeit sollte in der kontrollierten Umgebung (25 º C, 70% Luftfeuchtigkeit) zu nehmen, und der Kammer sollte auf der Oberseite des Licht-Box platziert werden (das sollte eingeschaltet sein). Schalten Sie anderen Raum Lichter aus.
2. Nach der Eingewöhnungszeit, schalten Sie das Y-Ventil in den Luftstrom so, daß die Luft nur auf das Messgerät fließen. Schalten Sie die Luft, und Rampe die Luft bis die gewünschte Geschwindigkeit (4,0-6,0 L / min). Wir verwenden in der Regel 5,0 bis 5,5 L / min, aber jeder Geschwindigkeit in diesem Bereich arbeiten werden.
3. Sobald die gewünschte Geschwindigkeit erreicht ist, schalten Sie das Y-Ventil, so dass die Luft strömt um die Fortbewegung Kammer. Die Zeit dieser Luft Puls für 15 Sekunden, und dann plötzlich wieder die Luft aus. Wie Sie die Luft auszuschalten, schalten Sie die Kamera im Aufnahme-Modus. (Dieser Teil braucht Übung, um alle auf einmal zu tun).
4. Beenden Sie die Aufnahme nach der gewünschten Zeit und SAVE. Wir erfassen 30 Sekunden Studien bei 10 Frames pro Sekunde (mindestens 8 Versuche pro Genotyp).

Teil 5: Analyse von Videos

1. Wir nutzen dieDynamic Image Analysis System (DIAS) Software 3.2 für ^{Motion-Tracking-2.} Um diese Software nutzen, haben wir zuerst konvertieren unsere Videos in eine AVI-Datei-Format mit Quicktime 7.5.5.
2. So verfolgen die Fliegen an Kontrast basiert, verwenden wir die "Autotrace von Threshold"-Funktion. Wir verwenden dann die "Make-Pfad von Trace"-Funktion zu digitalisieren diese Spuren.
3. Zur Ausgabe der momentanen Geschwindigkeiten der einzelnen fliegen, benutzen wir die "Compute-Parameter"-Funktion, um eine Datenbank-Datei zu erzeugen (DIAS-spezifisch). Mit dieser Funktion haben wir auch glatt die Daten mit Hilfe eines "5,15,60,15,5" Tukey Smoothing-Fenster.
4. Sobald diese Informationen als eine Datenbank-Datei ausgegeben wird, kann es in Microsoft Excel geöffnet werden. Wir verwenden ein Matlab-Skript, um die momentane Geschwindigkeit in Excel erstellen und berechnen zusätzliche Parameter, die zum Verständnis Bewegungsdynamik und Kampf-Struktur.

Repräsentative Ergebnisse:

Abbildung 1 zeigt repräsentative Spuren von Wildtyp Canton S Organismen (Abbildung 1, links) und fliegt null für die dCASK Gen, das durch die Kreuzung zweier großer Überlappung Deletionen (Df (3R) X307 und Df (3R) X313) (Abbildung 1 erzeugt wurden, , rechts). dCASK null Fliegen haben bisher gezeigt, dass Bewegungsapparat Probleme mit Buridans Paradigm ³ haben und in unser Paradigma, im Vergleich zu Canton S, zeigen sie sich sehr Fortbewegung zurück. Wir laufen immer Wildtyp Organismen ersten stellen Sie sicher, dass die Bedingungen und das Verhalten im normalen Bereich an einem bestimmten Tag werden. Wir haben Abweichungen von Standard-Antworten in weniger als 5% des Testens Tagen beobachtet. Diese Unterschiede können in der Regel zu Problemen mit den Parametern unserer kontrollierten Umgebung zugeschrieben werden.

Abbildung 1. DIAS-generated Spuren sowohl Wildtyp Canton S Fliegen (oben, links) und Bewegungsapparat-defizienten dCASK Null fliegt von überlappenden Deletionen (oben rechts) erzeugt. Die Spuren zu repräsentieren, was in den aufgezeichneten Videos gesehen. Beide Bilder kontraindiziert Spuren von 8 bis 10 fliegt für 30 Sekunden in der Video-Tracking-Assay nach einer Luft-Puls.

Abbildung 2. Wildtyp-Fliegen wurden in den Bewegungsapparat Assay (oben) nach einem Luft-Impuls (lila Balken) und ohne Luft-Impuls (blau) ausgeführt werden. In alle Parameter von der Analyse-Programm berechnet, gab es keine signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Bedingungen (bestimmt mit zweiseitigen Student t-Test). Dies zeigt, dass im Anschluss an eine Luft-Impuls, Fliegen fortbewegen normalerweise in unserer Einrichtung.

Discussion

In unserer Einrichtung, ein mäßig starkes Luftimpuls vorübergehend stoppt fliegen Bewegung. Wenn die Luft Impuls endet, werden die Fliegen von diesem stationären Zustand und Fortbewegung in der Regel frei, wie in Abbildung 2 dargestellt. Da diese Luft-Impuls effektiv synchronisiert Fortbewegung der Bevölkerung, verwenden wir sie in den Prozess zu beginnen, so dass wir auch studieren können, das Einsetzen der Bewegung nach einem Momentum-breaking Reiz. Der Test kann jedoch ohne Luftimpuls getan werden, da Bewegungsapparates Parameter nach Beginn unbeeinflusst von der Luft-Impuls (Abbildung 2).

Ein häufig auftretendes Problem mit automatisierten Analyse der Fortbewegung gesehen ist das Problem der Kollisionen. Tracking-Programme sind zum größten Teil notorisch schlecht im Umgang mit Fliegen, die kollidieren. Diese Programme oft verlieren "Anblick" eines Objekts kurzzeitig bei einer Kollision, und auf der Suche nach diesem Objekt beschriften Sie sie als neues Objekt. Das Ergebnis kann eine Leistung, die viel mehr Objekte verfolgt, als tatsächlich in der Kammer bestehen hat. Viele Menschen lösen dieses Problem durch Rückverfolgung einzelner Fliegen. Das offensichtliche Problem mit diesem ist jedoch, dass einzelne fliegen Verhalten kann sehr unterschiedlich sein als die Bevölkerung Verhalten aufgrund der Rolle der sozialen Signale in Drosophila Verhalten und Fortbewegung ^vier. Dies ist natürlich nicht unbedingt eine schlechte Sache, je nachdem, was Sie versuchen zu lernen, aber für unsere Zwecke, bevorzugen wir die Bevölkerung von Fliegen nutzen, um unsere statistische Aussagekraft zu erhöhen. Aus diesem Grund beschäftigen wir uns mit Kollisionen in zweierlei Hinsicht. Erstens verwenden wir nur 8-10 fliegt pro Versuch (in unserem 56 mm ² Kammer), so dass Kollisionen wird minimal sein. Zweitens, im Rahmen unserer 32. Versuchen wir analysieren nur Spuren, dass mindestens 18 Sekunden lang sind. Auf diese Weise sind wir immer Aufzeichnung genügend Zeit, um mehrere Anfälle von Bewegung in ihrer Gesamtheit zu erfassen. Damit ist auch sichergestellt, dass unsere Stichprobe spiegelt immer die Anzahl der Fliegen in einer Kammer, als kleinere Fragmente der Bewegung verworfen werden und die Gesamtlänge des Videos ist nur 30 Sekunden.

Datenanalyse kann der schwierigste Teil dieses ganzen Prozesses sein. Der wichtigste Schritt der Analyse Tracking-Daten, um den Unterschied zwischen Lärm und Bewegung bestimmen. DIAS (wie viele andere Programme) werden fast nie Ausgang einer Geschwindigkeit von 0 mm / s, auch wenn die Fliege hat aufgehört sich zu bewegen. Aus diesem Grund ist es wichtig, die Videos anzuschauen, während man die Datenausgabe Frame für Frame, um zu sehen, wenn die Organismen tatsächlich in Bewegung, und wenn sie nicht sind. In unserer Einrichtung, scheinen alle Geschwindigkeiten unterhalb von 1 mm / s Lärm, die im Einklang mit dem, was andere Gruppen mit DIAS haben mit adulten Fliegen ¹ gefunden wird. Zum Anschauen der Dynamik des Kampfes Struktur, braucht man auch eine Runde zu definieren. Wir definieren Tätigkeit als 3 oder mehr aufeinanderfolgende Frames Geschwindigkeit von über 1 mm / s, und Inaktivität als 3 oder mehr aufeinanderfolgende Frames unterhalb dieser Schwelle.

Die Daten müssen auch richtig geglättet werden, um Artefakte aus transient Licht flackert und Kamera Verzerrungen, die gelegentlich auftreten zu beseitigen. Es gibt keine Standardmethode für die Daten Glättung, aber es ist wichtig, dass die Glättung ändert nichts an der allgemeinen Tendenz der Daten zu stark, oder man kann Glättung Artefakte zu erzeugen. Wir zweimal glatt mit Tukey-Fenster von "5,15,60,15,5", weil sie keine großen Sprünge oder Änderungen in der Geschwindigkeit, die offensichtlich falsch sind, zu beseitigen scheint, ändert jedoch nichts an dem allgemeinen Trend oder die Art der Daten.

Es ist wichtig zu erkennen, dass verschiedene Setups und Umgebungen werden verschiedene Verhaltensweisen Resultate zu erzielen. Unsere Empfehlung an die Einrichtung eines Tracking-Test ist das Experimentieren mit allen diesen Fragen, bis Sie eine Methode, die Daten, die dem entspricht, was visuell zu erkennen ist, und dann so konsistent wie möglich in die Behandlung aller Daten auf die gleiche Weise produziert zu finden.

Die Auswahl der richtigen Tracking-Programm ist ebenfalls wichtig. Obwohl wir DIAS 3,2 (www.solltechnologies.com) verwenden, ist dies keineswegs die beste oder die einzige Lösung im Markt. Für die Verfolgung einzelner fliegt, hat Dan Valente (Mitra Lab, CSHL) ein Programm namens Ftrack entwickelt. Für mehrere Fliegen locomoting zusammen (dh, wo Kollisionen auftreten), hat Kristin Branson (Dickinson / Perona Labs, Caltech) ein Programm namens Ctrax entwickelt. Ftrack finden Sie unter www.chronux.org, während Ctrax finden Sie unter www.dickinson.caltech.edu / Forschung / Mtrax. Ethovision Software (Noldus, Niederlande) ist eine weitere leistungsfähige Option für Video-Tracking der beiden Einzel-und Mehrfach Fliegen, aber es ist nur im Handel erhältlich, und ist recht teuer.

Wenn Sie eine Tracking-Assay eingestellt haben und kann nicht zuverlässig Aufnahmen, es gibt ein paar Dinge zu beachten. Zirkadianen Rhythmus Fragen sind oft ein großes Problem. Bei der Ausführung von Verhaltensstörungen Assays, sollte man immer darauf achten, nicht zu fliegen während ihrer Mittagsruhe laufen. Da wir currently in Genen, die Rückgänge in der Bewegungsorgane Verhalten produzieren können interessierte, ziehen wir es vor Fliegen nahe am späten Nachmittag Aktivität peak (ZT 8-10) laufen. Ein weiteres Problem kann auch von inkonsistenten Luftstrom von der Quelle entstehen. Vor Beginn der Versuche, achten Sie darauf, um den Luftstrom mit dem Durchflussmesser testen, so dass es nicht stark schwanken über die 15 Sekunden Luft Puls. Schließlich kann der genetische Hintergrund eine Rolle in allen Verhaltens-Aufgaben spielen, so dass einige der Parameter dieses Tests müssen Sie sich für einen bestimmten Hintergrund optimiert werden.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Square Chamber	Tool	Machine Shop	N/A	Design from Wolf et al. 20021
Digital Camera	Camera	Sharp	ViewcamZ VL-23
Flowmeter	Tool	Cole-Parmer	SY-32003-12
Light Box	Tool	DNASTAR	Seq-Easy
Charcoal Filter	Tool	Fisher Scientific	09-744-37
DIAS 3.2	Software	Soll technologies	N/A	www.solltechnologies.com