Summary
の複雑な運動挙動の研究
Abstract
ハエは、この分野の研究者に利用可能な遺伝的なツールの過多に起因する複雑な挙動を研究するための重要なモデルを提供しています。における運動行動を研究して
Protocol
パート1：ハエの餌と管理
- ハエは、酵母のない標準のメディアを含むボトルで増殖させてください。あなたは、ハエを大量に必要になりますので、十字架は、それに応じて設定する必要があります。 25℃で暗サイクル：ハエは、12時間の光で栽培する必要がある
- ハエはすぐに羽化（1-3日）後に収集する必要があります。ハエは、二酸化炭素のディフューザーを使用して、この段階で働いたことができ、オートクレーブまたは酵母培地を含む試験管にソートしておく必要があります。我々は、試験管にのみ、保存されている男性10を使用してください。
- 行動実験を実行する前に、二酸化炭素の使用後に少なくとも一日か二日を許可する。私たちは行動アッセイ3-5日以下の羽化にハエを実行する。
- アッセイは、常に概日リズムの問題を回避するために、毎日同じ2〜3時間の時間ウィンドウ内で実行する必要があります。
パート2：管理された環境での追跡システムのセットアップ
- 全ての実験は、70％の湿度と25℃の一定温度を維持する環境の部屋で行われます。
- （カメラが下向き）に記録される領域の上にデジタルビデオカメラを一時停止します。私たちのトラッキングソフトウェアは、コントラストをベースにしているので、我々は、ライトボックス上のカメラを一時停止する。カメラは、FireWire接続を介して直接のDellコンピュータにビデオを記録します。我々は、ビデオの取り込みのためのWindows映画制作者（Vistaのバージョン）でのDellコンピュータにフックアップする、シャープデジタルビデオカメラを使用してください。
- 空気パルスがこのプロトコルで投与される、空気の流れのソースは、客室内に存在しなければならないので。ゴムチューブを使用して、空気ろ過用活性炭フィルターに空気源を接続してください。
- より多くのゴムチューブを使用して、中空のゴム栓を経由して三角フラスコに活性炭フィルターの反対側を接続し、そして水の半インチ程度とフラスコを埋める。これは、空気を加湿します。
- フラスコには、ゴムチューブを経由してY字型バルブに接続するサイドアームを、持つ必要があります。
- Y -バルブの一枝は、流量計に接続する必要があります。他の支店は、正方形の運動室に空気を配布する必要があります。
パート3：運動室にハエを配信
- 正方形の運動室は、Wolf らの設計に基づいています。2002年1は 、チャンバ内に飛んでからハエを防ぐための小さなドロップトレイを追加して。チャンバーを分解する必要があり、すべてのコンポーネントが完全に70％エタノールでダウン拭いて、使用前に乾燥する必要があります。
- すぐに行動試験を行う前に麻酔は、潜在的にパフォーマンスが損なわれる可能性があります。これを避けるために、ハエが優しく小さなアウトレットで漏斗を用いてチャンバーにノックされています。正しいサイズのアウトレットを作成するには、漏斗の端に青色のピペットの先端を（P1000用）を取り付けます。通過するフライ用に十分な開口部が大きいために、ピペットチップの非常に端を切断するはさみを使用してください。
- 私たちの部屋の上部は、エッジの周りのねじで固定プレキシガラスの小片です。ネジが削除されたときに、穴がチャンバー内にハエを提供するために使用することができます。ネジ穴は、ネジが正常に座っている場所の代わりに、内部の部屋の上に直接座っているように、プレキシガラスの上に置きます。ハエを含む試験管を取るし、ネジ穴に配置する必要が漏斗、上の逆さまに置きます。
- これは、ハエを傷つけたり、破損の原因と、漏斗を移動しないでください。すべてのハエがチャンバー内になるまで、その代わりに、穏やかに、全体のチャンバー、ファンネルとすべてをたたく。このノッキングは、このバンギングの衝撃を吸収するためにマウスパッド上で行ってください。ハエが内側にある場合はネジのベッド上のプレキシガラスの上を、漏斗を削除し、再位置。所定の位置にして再度ネジプレキシガラスのトップ。
パート4：運動アッセイを実行する
- ハエが正しくロードされたら、それらを30分間チャンバーに順化てみましょう。この順化期間が制御された環境（25℃、湿度70％）内で起こるべきであり、チャンバーは、（これがオンしてください）ライトボックスの上に配置する必要があります。他の部屋の照明をオフにしてください。
- 順応期間の後、空気のみを流量計に流入するように空気の流れのシステムでY -バルブを切り替える。空気の電源をオンにして、希望の速度（4.0〜6.0 L /分）に空気を増加させる。我々は一般的に5.0〜5.5 L / minを使用しますが、その範囲内の任意の速度で動作します。
- 希望の対気速度が達成されると、空気が移動チャンバーに流れるようにY -バルブを切り替える。時間は、この空気は、15秒間パルスし、突然空気をオフにしてください。あなたが空気を切るように、モードを記録するカメラを切り替えます。 （この部分は一度にすべてを行うには練習が必要）。
- 希望の時間後に録画が停止して保存。我々は、毎秒10フレーム（遺伝子型ごとに少なくとも8試験）で30秒の試行を記録する。
パート5：動画の分析
- 我々は、使用動的画像解析システム（DIAS）2モーショントラッキングするためのソフトウェア3.2。このソフトウェアを使用するためには、我々は最初のQuickTime 7.5.5で、AVIファイルフォーマットに私たちの動画を変換。
- コントラストに基づいて、ハエを追跡するために、我々は、関数"しきい値で自動トレース"を使用してください。私たちは、その後、デジタル化への"トレースからパスを作成"機能は、これらのトレースを使用してください。
- 各フライの瞬時速度を出力するには、我々は（DIAS固有）データベースファイルを生成するために"計算パラメータ"機能を使用してください。この機能を使用して、我々はまた、"5,15,60,15,5"Tukeyの平滑化ウィンドウを使用してデータを平滑化。
- この情報はデータベースファイルとして出力されると、それはMicrosoft Excelで開くことができます。我々は、Excel内の瞬時速度をコンパイルし、運動のダイナミクスと試合の構造を理解するために必要な追加パラメータを計算するためにMatlabのスクリプトを使用してください。
代表的な結果：
図1は、野生型カントンS生物（図1、左パネル）から代表的なトレースを示しており、二つの大きなオーバーラップ失（DF（3R）X307とDF（3R）x313）（図1を交配することによって生成されたdCASK遺伝子にnullを飛ぶ、）パネル右側。dCASKヌルハエは、以前にビュリダンのパラダイム3を使用して運動に問題があることが示されている、と私たちのパラダイムでは、カントンSと比較して、彼らは大幅に減少運動を示す。我々は常に条件と動作が特定の日の正常範囲内であることを確認する最初の野生型の微生物を実行します。私たちは、試験日の5％未満で、標準の応答からの偏差を観測した。これらの違いは、通常、私たちの制御された環境のパラメータを持つ問題に起因することができます。
図1。DIAS -生成カントンS野生型のハエ（上記、左）とオーバーラップ欠失（上記、右）から生成された運動欠損dCASKのヌルハエの両方のトレースを。トレースが記録されたビデオで見ていることを象徴している。 80から10ハエから両方の画像contrainトレースは、空気のパルスは、次のビデオトラッキングアッセイで30秒間実行する。
図2野生型のハエは、空気のパルスに続く歩行分析（上）（紫のバー）にして空気パルス（青色）なしで実行されました。分析プログラムによって計算されたすべてのパラメータでは、2つの条件（両側スチューデントt -テストで決定）の間に有意差はなかった。これは空気パルス後、我々のセットアップでは正常に動き回る飛ぶことを示している。
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Discussion
我々のセットアップでは、やや強い空気のパルスは、一時的にハエの動きを停止します。空気のパルスが終了すると、ハエは、図2に示すように、この定常状態と正常に動き回るから解放されています。この空気のパルスが効果的に人口の移動を同期化されるため、我々はまた勢い破りの刺激に続く運動の発症を学ぶことができるように試験を開始するために使用。開始後自発運動のパラメータが空気パルス（図2）の影響を受けないので、このアッセイは、しかし、空気のパルスなしで行うことができます。
ロコモーションの自動解析で見られるものが頻繁に発生する問題は、衝突の問題です。トラッキングプログラムには、衝突ハエを扱う時悪名高く悪いほとんどの部分です。これらのプログラムは、しばしば衝突時に瞬間的にオブジェクトの"視力"を失う、そしてそれは新しいオブジェクトとして、このオブジェクトのラベルを見つけた上で。結果は、実際にチャンバー内に存在するよりも、トレース、より多くのオブジェクトを持つ出力することができます。多くの人々は、単一のハエをトレースすることでこの問題を解決する。これに明らかな問題は、しかし、その単一のフライの動作では、 ショウジョウバエの行動と歩行4の社会的手がかりの役割に起因する人口の動作よりも非常に異なるかもしれないです。これは、もちろん、あなたが勉強しようとしているかに応じて、必ずしも悪いことではありませんが、私たちの目的のために、我々の統計的検出力を高めるためにハエの個体群を使用することを好む。このため、我々は2つの方法で衝突を扱う。最初に、我々は唯一の試験ごとに80〜10ハエを（私たちの56ミリメートル平方室で）使用するので、その衝突は最小限になります。第二に、私たちの第三十二試験の中で、我々の長さは少なくとも18秒であるトレースを分析する。これを行うことによって、我々は常にその全体が動きの複数の発作をキャプチャするために十分な時間を記録している。これはまた、動きの小さいフラグメントが廃棄されると、我々のサンプルのサイズは常に、チャンバー内のハエの数を反映していることを保証し、ビデオの合計の長さはわずか30秒です。
データ解析は、このプロセス全体の中で最も困難な一部にすることができます。追跡データを解析の最も重要なステップは、ノイズや動きの違いを決定することです。 DIASは、（他の多くのプログラムのような）その場は移動を停止した場合であっても、0 mm / sの速度を出力することはほとんどないでしょう。このため、それは生物が運動に実際に存在する、そしてときにそうでないときに表示するフレームによってデータの出力フレームを見ながらビデオを鑑賞することが重要です。我々のセットアップでは、1mm / s以下のすべての速度は、DIASを使用して他のグループは成人のハエ1で発見したものと一致しているノイズ、と思われる。試合の構造のダイナミクスを調べるために、一つでも試合を定義する必要があります。我々は、この閾値以下に3つ以上の連続するフレームとして、3つ以上の連続する1 mm / sの上記の速度のフレーム、および非アクティブとして活動を定義する。
データはまた、適切に時折発生する、過渡的な光のちらつきとカメラの歪みからアーティファクトを除去するために平滑化する必要があります。そこにデータを平滑化する標準的な方法はありませんが、それは、平滑化のプロセスがあまりにも大幅にデータの一般的な傾向を変更しない、または1つのスムージングアーティファクトを生成できることが重要です。それは明らかに間違っているの速度の大ジャンプや変更を排除するようだが、データの全体的な傾向や性質を変更しないので、私たちは、"5,15,60,15,5"のテューキーウィンドウで二回を滑らかに。
異なる設定や環境が異なる行動の成果を生み出すことを認識することが重要です。あなたが同じ方法ですべてのデータを扱うにはできる限り一貫性あるものとして視覚的に見ることができる一致するものとするデータを制作する方法を見つける、とまでは追跡アッセイを設定する人に私たちの勧告は、これらの問題のすべてを試してみることです。
右追跡プログラムの選択も重要です。我々はDIAS 3.2（www.solltechnologies.com）を使用していますが、これは決して利用できる最良または唯一のシステムを意味することです。単一のハエの追跡が、ダンヴァレンテ（ミトララボ、CSHL）はFtrackと呼ばれるプログラムを開発しました。 （衝突が発生する可能性がある、すなわち、）一緒にlocomoting複数のハエのために、クリスティンブランソン（ディキンソン/ Perona研究所、カリフォルニア工科大学）がCtraxと呼ばれるプログラムを開発しました。 Ctraxがwww.dickinson.caltech.edu /リサーチ/ Mtraxで利用可能な間Ftrackは、www.chronux.orgで入手可能です。 Ethovisionソフトウェア（Noldus、オランダ）は、単一および複数のハエのビデオトラッキング用に使用できる別の強力なオプションですが、それは唯一の市販されており、かなり高価です。
あなたが追跡アッセイを設定していると信頼性の高い記録を得ることができない場合、次の事項を考慮する必要があります。概日リズムの問題はしばしば大きな問題です。行動アッセイを実行する場合は、1つは常に彼らの正午昼寝中にハエを起動したりしないことを確認する必要があります。我々はcurreですのでntly運動行動の減少を作り出すことができる遺伝子に興味を持って、我々は午後遅くの活性ピーク（ZT 8-10）の近くにハエを実行することを好む。もう一つの問題はまた、ソースからの一貫性のない空気の流れから生じることもできます。試験を開始する前に、それが15秒空気のパルスにわたって大きく変動しないように、流量計と空気の流れをテストしてください。最後に、遺伝的背景は、すべての行動タスクに役割を果たすことができるので、このアッセイのいくつかのパラメータは、特定の背景用に最適化する必要があります。
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Acknowledgments
この作業は、LCグリフィスに授与健康グラントR01 GM54408の国立研究所によってサポートされていました。私たちは、正方形のチャンバーを設計し、当社のチャンバーを構築し、そして分析の問題に関する有益な会話のためのDanバレンテとティムLebestkyのためのブランダイス大学の機械工場弊社のアッセイ、フランクメロのセットアップのすべての彼の助けのためにフレッドウルフに感謝します。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Square Chamber | Tool | Machine Shop | N/A | Design from Wolf et al. 20021 |
| Digital Camera | Camera | Sharp | ViewcamZ VL-23 | |
| Flowmeter | Tool | Cole-Parmer | SY-32003-12 | |
| Light Box | Tool | DNASTAR | Seq-Easy | |
| Charcoal Filter | Tool | Fisher Scientific | 09-744-37 | |
| DIAS 3.2 | Software | Soll technologies | N/A | www.solltechnologies.com |
References
- Wolf, F. W., Rodan, A. R., Tsai, L. T. High-Resolution Analysis of Ethanol-Induced Locomotor Stimulation in Drosophila. J Neurosci. 22 (24), 11035-11044 (2002).
- Soll, D. R. The use of computers in understanding how animal cells crawl. International review of cytology. 163, 43-104 (1995).
- Martin, J. R., Ollo, R. A new Drosophila Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase (Caki) is localized in the central nervous system and implicated in walking speed. The EMBO journal. 15 (8), 1865-1876 (1996).
- Levine, J. D., Funes, P., Dowse, H. B. Resetting the Circadian Clock by Social Experience in Drosophila melanogaster. Science. 298, 2010-2012 (2002).
