Summary
इन्फ्लूएंजा ए वायरस के जीनोम आरएनए और प्रोटीन के आठ अलग - अलग परिसरों, करार दिया वायरल ribonucleoprotein परिसरों (vRNPs) के होते हैं. इस कागज ग्लिसरॉल ढाल शुद्धि और इन्फ्लूएंजा vRNPs के संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी दृश्य का वर्णन करता है.
Abstract
इन्फ्लूएंजा एक वायरल जीनोम आठ भावना नकारात्मक, एकल असहाय शाही सेना अणु, व्यक्तिगत nucleoprotein वायरल ribonulceoprotein कण (vRNPs) में इन्फ्लूएंजा (NP) के एकाधिक प्रतियों के साथ पैक के होते हैं. इन्फ्लूएंजा vRNPs वायरल लिफाफे के भीतर संलग्न हैं. सेल प्रविष्टि के दौरान, तथापि, इन vRNP परिसरों cytoplasm में जारी कर रहे हैं, जहां वे मेजबान परमाणु परिवहन मशीनरी के लिए पहुँच प्राप्त है. आदेश में इन्फ्लूएंजा vRNPs और इन्फ्लूएंजा जीनोम की प्रतिकृति के परमाणु आयात अध्ययन करने के लिए, यह उपयोगी है पृथक vRNPs के साथ काम इतना है कि वायरस के अन्य घटकों इन प्रक्रियाओं के साथ हस्तक्षेप नहीं करते. यहाँ, हम एक इन्फ्लूएंजा ए वायरस से इन vRNPs शुद्ध प्रक्रिया का वर्णन करता है. प्रक्रिया डिटर्जेंट के साथ एक virion इन्फ्लूएंजा के विघटन के साथ शुरू होता है क्रम में छा virion से vRNP परिसरों जारी है. vRNPs तो 33-70% वेग अवसादन के द्वारा असंतत ग्लिसरॉल ढाल पर एक virion इन्फ्लूएंजा के अन्य घटकों से अलग हो रहे हैं. ग्लिसरॉल ढाल से प्राप्त भिन्न तो Coomassie नीले के साथ धुंधला के बाद एसडीएस पृष्ठ के माध्यम से विश्लेषण कर रहे हैं. पीक एनपी युक्त भिन्न तो एक साथ जमा कर रहे हैं और centrifugation द्वारा केंद्रित. एकाग्रता के बाद, vRNPs की अखंडता नकारात्मक धुंधला के बाद संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा vRNPs दृश्य द्वारा सत्यापित है. ग्लिसरॉल ढाल शुद्धि Kemler से है कि एक संशोधन है
Protocol
भाग 1: एक virion इन्फ्लुएंजा के व्यवधान
- एक Beckman polycarbonate अपकेंद्रित्र (11 मिमी x 34 मिमी) ट्यूब Beckman ऑप्टिमा में इस्तेमाल के लिए एक रोटर TLA-120.2 में फिट करने के लिए डिज़ाइन में MNT बफर के 750 μl (20 मिमी एमईएस, 150 मिमी NaCl, 30 मिमी Tris, पीएच 7.5) जोड़ें मैक्स ई ultracentrifuge.
- उस ट्यूब में, इन्फ्लूएंजा ए वायरस (2 मिलीग्राम / एमएल H3N2 X-31 A/AICHI/68 तनाव) के 500 μl जोड़ें. MNT बफर के साथ ऊपर और नीचे pipetting कई बार वायरस मिक्स.
- 109.000 XG, 4 ° C पर 10 मिनट के लिए Beckman ऑप्टिमा मैक्स ई एक रोटर TLA-120.2 का उपयोग अपकेंद्रित्र में, अपकेंद्रित्र.
- सतह पर तैरनेवाला निकालें, और resuspend गोली 500 μl व्यवधान बफर में (100 मिमी KCl, 5 मिमी 2 MgCl, 5% ग्लिसरॉल (w / v), 50 मिमी octylglucoside, 10 मिलीग्राम / एमएल lysolecithin, 1.5 मिमी dithiothreitol, 100 मिमी एमईएस, 5.5 पीएच).
- भंवर सख्ती, और फिर 31 पर हिला ° C एक Eppendorf thermomixer में 20 मिनट के लिए.
भाग 2: ग्लिसरॉल ढाल तलछट वेग centrifugation
- : 1 मिलीलीटर 70% (v v /) ग्लिसरॉल, 0.75 मिलीलीटर 50% ग्लिसरॉल मिलीलीटर .375, 40% ग्लिसरॉल, और 1.8 के Beckman ultraclear अपकेंद्रित्र (13 x 51 मिमी) ट्यूब में ग्लिसरॉल के निम्नलिखित मात्रा रखकर एक ग्लिसरॉल ढाल तैयार मिलीलीटर 33% ग्लिसरॉल. ग्लिसरॉल समाधान NM बफर (150 मिमी NaCl, 50 मिमी एमईएस, 5.5 पीएच) के साथ शुद्ध ग्लिसरॉल मिश्रण से बना रहे हैं. इसके अलावा एक संतुलन दोनों ग्लिसरॉल और बफर युक्त ट्यूब तैयार करते हैं.
- भंवर वायरल नमूना फिर से बाधित है, और यह ग्लिसरॉल ढाल पर लोड हैं.
- 217.000 XG, 4 डिग्री सेल्सियस पर 3.75 घंटे के लिए एक Beckman MLS 50 रोटर झूल बाल्टी में ढाल अपकेंद्रित्र,.
- Centrifugation के बाद पूरा हो गया है, मैन्युअल रूप से ट्यूब के ऊपर से शुरू ढाल के 250 μl aliquots इकट्ठा. बर्फ पर या 4 डिग्री सेल्सियस भिन्न रखें
भाग 3: ग्लिसरॉल ढाल Fractions की एसडीएस polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा विश्लेषण
- प्रत्येक अंश से एक ताजा ट्यूब 20 μl निकालें.
- 5x एसडीएस पृष्ठ नमूना बफर के 5 μl जोड़ें.
- 95 के लिए हीट ° C 5 मिनट के लिए.
- नीचे नमूने संक्षिप्त स्पिन और एक 10% polyacrylamide जेल पर उन्हें लोड, और कुओं की आणविक भार मार्करों शामिल है.
- जेल पर नमूने भागो bromphenol नीले लोडिंग डाई तक जेल के नीचे के करीब पहुँचता है.
- Coomassie नीले रंग के साथ जेल दाग.
भाग 4: vRNP Fractions की एकाग्रता
- ग्लिसरॉल मुख्य रूप से एनपी युक्त भिन्न चुनें, उन्हें गठबंधन, और उन्हें दो Beckman polycarbonate अपकेंद्रित्र ट्यूब (11 मिमी x 34 मिमी) में वितरित.
- Diethyl pyrocarbonate (DEPC) - इलाज Ultrapure पानी, और pipet और नीचे मिश्रण करने के लिए कई बार के साथ प्रत्येक ट्यूब भरें.
- 157.000 XG, 4 ° C में 4.5 घंटे के लिए एक Beckman TLA 120.2 रोटर में, अपकेंद्रित्र.
- सतह पर तैरनेवाला निकालें, और DEPC पानी का इलाज के 50 μl में गोली resuspend.
- अगर वांछित, केंद्रित vRNPs के 280 मापा जा सकता है. के रूप में एनपी जमा भागों में प्रमुख घटक मौजूद है, एनपी के molarity के एक अनुमान 55,350 के विलुप्त होने गुणांक -1 एम सेमी -1 (के रूप में ProtParam के माध्यम से 3 निर्धारित) का उपयोग कर की गणना जा सकता है.
- शुद्ध vRNPs विभाज्य, और उन्हें -80 में जमे हुए डिग्री सेल्सियस बाद में उपयोग के लिए दुकान.
भाग 5: vRNPs के नकारात्मक धुंधला
- 9 के μl में शुद्ध vRNP 1 μl पतला हौसले से बनाया है और फ़िल्टर्ड दो बार MNT बफर (20 मिमी एमईएस, 150 मिमी NaCl, 30 मिमी Tris, 7.5 पीएच). अन्य बफ़र्स भी vRNPs पतला और नमूना ग्रिड (5.5 कदम) धोने के लिए ठीक है, लेकिन का उपयोग करें यदि uranyl एसीटेट नकारात्मक धुंधला के लिए प्रयोग किया जाता है नहीं पीबीएस.
- चमक निर्वहन एक नमूना (तांबा) मंदिर के पहले और 30 सेकंड के लिए कार्बन फिल्म parlodion के साथ लेपित ग्रिड.
- हौसले से चमक छुट्टी चिमटी के साथ नमूना ग्रिड पकड़ो, और नमूना ग्रिड पर एक 5 पतला vRNP के ड्रॉप μl लागू.
- 8 मिनट के लिए ग्रिड पर नमूना की बूंद छोड़ो.
- जबकि प्रतीक्षा, Parafilm की बेंच पर एक छोटी सी पट्टी जगह है, और 2 10 μl MNT बफर के प्रत्येक (ग्रिड धोने), और हौसले से बनाया धुंधला समाधान की एक बूंद 80 μl (1% अमोनियम molybdate या 1 युक्त बूँदें बग़ैर % Parafilm पर uranyl एसीटेट).
- सोखना के 8 मिनट के बाद, फिल्टर पेपर के एक टुकड़े के साथ नमूना ग्रिड (त्रिकोण में कटौती) से नमूना समाधान का हिस्सा बाती. नमूना ग्रिड शुष्क करने के लिए मत देना.
- 2 1 मिनट की कुल समय के लिए 10 μl MNT बफर के प्रत्येक युक्त बूंदों में नमूना ग्रिड धो लें. यह ध्यान से ड्रॉप पर नमूना ग्रिड को कम, और तब बंद फिल्टर पेपर के एक टुकड़े के साथ नमूना ग्रिड (नमूना ग्रिड सूखी दे के बिना) से नमूना समाधान के हिस्से के wicking द्वारा किया जाता है.
- बंद नमूना ग्रिड से बफर के अंतिम ड्रॉप wicking के तुरंत बाद पूरा,ly डूब दाग छोटी बूंद नमूना ग्रिड के भीतर और एक मिनट रुको.
- पूरी तरह से फिल्टर पेपर के एक टुकड़े के साथ नमूना ग्रिड से दाग समाधान बाती.
- हवा सूखी एक संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के अंतर्गत अवलोकन के पहले कई मिनट के लिए नमूना ग्रिड की अनुमति दें.
भाग 6: प्रतिनिधि परिणाम:
चित्रा 1
इन्फ्लूएंजा एनपी (~ 56 केडीए) के रूप में प्रमुख प्रोटीन वायरल ribonucleoprotein परिसरों में पाया है, एनपी बैंड vRNPs (चित्रा 1) युक्त भागों में आम तौर पर मजबूत बैंड है. एनपी अलावा, प्रत्येक इन्फ्लूएंजा vRNP भी trimeric शाही सेना (82, 86 और 86.5 केडीए की आणविक भार) पोलीमरेज़ जटिल की एक प्रति शामिल हैं. ये हो सकता है या हो सकता है क्योंकि उनकी बहुतायत कम एनपी के लिए तुलना में है Coomassie नीले धुंधला द्वारा दिखाई नहीं हो सकता है. पीसीआर, लेकिन पता चला, अगर, बजाय एक Commassie दाग नीले, एक चांदी की जेल प्रदर्शन है दाग कर सकते हैं. इन्फ्लूएंजा मैट्रिक्स प्रोटीन M1 (~ 28 केडीए) न्यूनतम भिन्न जहाँ एनपी प्रोटीन चोटी भिन्न मौजूद हैं में मौजूद होना चाहिए.
चित्रा 2
कल्पना के रूप में एक संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के तहत नकारात्मक से सना हुआ vRNPs vRNPs कि चर लंबाई के साथ छड़ के आकार के कणों कि लंबाई में 120 एनएम (2a चित्रा) को लगभग 30 एनएम समान उपज चाहिए. oligomeric एनपी एनपी अणुओं की एक श्रृंखला है कि आगे एक डबल पेचदार दोहराने संरचना में जोड़ रहा है के रूप में संगठित किया है, तो इन छड़ के आकार के कणों के दोनों सिरों पर loops कभी कभी देखा जा सकता है (चित्रा 2b) है.
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Discussion
vRNPs की शुद्धि Kemler एट अल (1994) द्वारा वर्णित की प्रक्रिया पर आधारित है 1 हम और दूसरों को भी इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया है vRNPs को अलग करने के लिए अपने परमाणु आयात अध्ययन. 2,4,5
हम RNase मुफ्त सुझावों और ट्यूबों जब vRNPs छेड़खानी का उपयोग की सलाह देते है क्योंकि वायरल जीनोम शाही सेना के बना है, और इसलिए आसानी से शाही सेना की उपस्थिति में degrades. इसके अलावा, सभी बफ़र्स पानी है कि RNase मुक्त है में किया जाना चाहिए. प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित एक अम्लीय निष्कर्षण (जैसे विघटन बफर और ग्लिसरॉल ढाल का पीएच 5.5) के साथ प्रदर्शन किया गया था. इसी तरह, एक बुनियादी निष्कर्षण एमईएस, Tris, पीएच 7.8 के साथ 5.5 पीएच द्वारा प्रतिस्थापित हो सकता है (के रूप में Kemler एट अल (1994) 1 द्वारा वर्णित) प्रदर्शन कर सकते हैं.
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Acknowledgments
इस काम अभिनव के लिए कनाडा फाउंडेशन (CFI), स्वास्थ्य अनुसंधान (CIHR) के कनाडा संस्थान, और प्राकृतिक विज्ञान और कनाडा के इंजीनियरिंग रिसर्च काउंसिल () NSERC से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| H3N2 X-31 A/AICHI/68 influenza A | Charles River Laboratories | 490715 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M-8250 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-1 | |
| Octylglucoside | Sigma-Aldrich | O-8001 | |
| Lysolecithin | Sigma-Aldrich | L-4129 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D-9779 | |
| Coomassie brilliant blue G-250 | Kodak | 1367796 | |
| diethyl pyrocarbonate (DEPC)-treated water | Invitrogen | 750024 | |
| Uranyl Acetate | Ted Pella, Inc. | 19481 | |
| Ammonium Molybdate | Fisher Scientific | A-674 | |
| Optima MAX-E Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | 434491 | |
| MLS-50 Rotor Package, Swinging Bucket | Beckman Coulter Inc. | 367280 | |
| TLA-120.2 Rotor Assembly, Fixed-Angle, Titanium | Beckman Coulter Inc. | 362046 | |
| Eppendorf Thermomixer | Lauda Brinkmann | 022670000 |
References
- Kemler, I., Whittaker, G., Helenius, A. Nuclear import of microinjected influenza virus ribonucleoproteins. Virology. 202, 1028-1033 (1994).
- Wu, W. W. H., Weaver, L. L., Panté, N. Ultrastructural analysis of the nuclear localization sequences on influenza a ribonucleoprotein complexes. J Mol Biol. 374, 910-916 (2007).
- Gasteiger, E. The Proteomics Protocols Handbook. Walker, J. M. , Humana Press. 571-607 (2005).
- Wu, W. W. H., Sun, Y. H. B., Panté, Nuclear import of influenza A viral ribonucleoprotein complexes is mediated by two nuclear localization sequences on viral nucleoprotein. Virol J. 4, 49-49 (2007).
- Babcock, H. P., Chen, C., Zhuang, X. Using single-particle tracking to study nuclear trafficking of viral genes. Biophys J. 87, 2749-2758 (2004).
