Summary
Genomet av influensa A-virus består av åtta separata komplex av RNA och proteiner, kallade virala ribonucleoprotein komplex (vRNPs). Detta dokument beskriver rening glycerol lutning och transmissionselektronmikroskopi visualisering av influensa A vRNPs.
Abstract
Influensa A virala genomet består av åtta negativ bemärkelse, enda RNA-molekyler, individuellt packad med flera kopior av influensa A nukleoprotein (NP) i virus ribonulceoprotein partiklar (vRNPs). Den influensa vRNPs är innesluten i den virala kuvertet. Under cellinmatning, dock dessa vRNP komplex släppas ut i cytoplasman, där de får tillgång till värden kärntransport maskiner. För att studera det nukleära import av influensa vRNPs och replikation av influensavirus genomet, är det bra att arbeta med isolerade vRNPs så att andra delar av viruset inte stör dessa processer. Här beskriver vi en procedur för att rena dessa vRNPs från influensa A-virus. Förfarandet inleds med störningar av influensa A-virus med tvättmedel för att lossa vRNP komplex från insvept virionens. Den vRNPs separeras sedan från andra delar av influensa A virus på en 33-70% diskontinuerlig glycerol lutning av hastighet sedimentering. De procenttal som erhålls från glycerol gradienten analyseras sedan på via SDS-PAGE efter färgning med Coomassie blå. Den högsta fraktioner som innehåller nonylfenol sedan sammanförs och koncentreras genom centrifugering. Efter koncentrationen är integritet vRNPs kontrolleras av visualisering av vRNPs genom transmissionselektronmikroskop efter negativa färgning. Den glycerol lutning reningen är en modifiering av det från Kemler
Protocol
Del 1: Rubbning av influensa A Virion
- Tillsätt 750 ìl MNT buffert (20 mM MES, 150 mM NaCl, 30 mM Tris, pH 7,5) till en Beckman polykarbonat centrifugrör (11 mm x 34 mm) utformad för att passa in i en TLA-120,2 rotor för användning i en Beckman Optima Max-E ultracentrifugen.
- Tillsätt 500 ìl av influensa A-virus (H3N2 X-31 A/AICHI/68 stam, 2 mg / ml) in i det röret. Blanda viruset med MNT buffert genom att pipettera upp och ned flera gånger.
- Centrifugera i 10 minuter vid 109.000 xg, 4 ° C, i en Beckman Optima Max-E-centrifugen med en TLA-120,2 rotorn.
- Avlägsna supernatanten och suspendera pelleten i 500 l avbrott buffert (100 mM KCl, 5 mm MgCl 2, 5% (w / v) glycerol, 50 mm octylglucoside, 10 mg / ml lysolecithin, 1,5 mm ditiotreitol, 100 mm MES, pH 5,5).
- Vortex kraftfullt, och sedan skaka vid 31 ° C i 20 minuter i ett Eppendorf thermomixer.
Del 2: Glycerol Gradient Sediment Velocity Centrifugering
- Förbered en glycerol lutning genom att placera följande belopp av glycerol i en Beckman UltraClear centrifugrör (13 mm x 51 mm): 1 ml 70% (v / v) glycerol, 0,75 ml 50% glycerol, 0,375 ml 40% glycerol och 1,8 ml 33% glycerol. Glycerol lösningar görs genom att blanda ren glycerol med NM buffert (150 mM NaCl, 50 mM MES, pH 5,5). Också utarbeta en balans rör som innehåller både glycerol och buffert.
- Vortexa störde virus prov igen, och ladda den på glycerol lutning.
- Centrifugera gradienten för 3,75 timmar vid 217.000 xg, 4 ° C, i en Beckman MLS-50 svängande-hink rotorn.
- När centrifugeringen är klar manuellt samla in 250 l alikvoter av gradienten börjar från toppen av röret. Håll bråk på is eller vid 4 ° C.
Del 3: Analys av de fraktioner som Glycerol Gradient med SDS polyakrylamidgelelektrofores
- Ta bort 20 l från varje fraktion till ett nytt rör.
- Tillsätt 5 ìl 5x SDS-PAGE prov buffert.
- Värm till 95 ° C i 5 minuter.
- Spinn ner proverna kort och ladda upp dem på en 10% polyakrylamidgel och inkluderar molekylvikt markörer i en av brunnarna.
- Kör proverna på gelen tills bromfenolblått laddningsfärg når nära botten av gelen.
- Fläck gelen med Coomassie blå.
Del 4: Koncentration av vRNP Bråk
- Välj glycerol fraktioner som innehåller främst NP, kombinera dem och distribuera dem i två Beckman polykarbonat centrifugrör (11 mm x 34 mm).
- Fyll varje rör med dietyleter pyrocarbonate (DEPC)-behandlad ultrarent vatten, och pipettera upp och ned flera gånger för att blanda.
- Centrifugera i 4,5 timmar vid 157.000 xg, 4 ° C, i en Beckman TLA-120,2 rotorn.
- Avlägsna supernatanten och suspendera pelleten i 50 ìl DEPC-behandlat vatten.
- Om så önskas kan A-280 i koncentrerad vRNPs mätas. Eftersom NP är den främsta komponenten närvarande i poolade fraktionerna kan en uppskattning av molaritet NP beräknas med hjälp av sin extinktionskoefficienten för 55.350 M -1 cm -1 (som bestäms via ProtParam 3).
- Alikvotera det renade vRNPs och lagra dem frysta vid -80 ° C för senare användning.
Del 5: negativ färgning av vRNPs
- Späd 1 l renat vRNP i 9 ìl nygjord och filtreras-två gånger MNT buffert (20 mM MES, 150 mM NaCl, 30 mM Tris, pH 7,5). Andra buffertar är också OK för att späda ut vRNPs och tvätta provet nätet (steg 5,5), men inte använda PBS om AUC acetat används för negativ färgning.
- Glow-utsläpp ett prov (koppar TEM) rutnät som tidigare belagd med en parlodion och kol-film för 30 sekunder.
- Håll nyligen självlysande ut exemplar rutnät med pincett, och tillämpa en 5-l droppe utspädd vRNP mot provexemplaret nätet.
- Lämna droppe av provet på nätet i 8 minuter.
- Medan du väntar, placera en liten remsa av Parafilm på bänken, och fördela 2 droppar innehållande 10 l respektive MNT buffert (för att tvätta nätet), och en 80-l droppe av nybakade färglösningen (1% ammoniummolybdat eller 1 % AUC acetat) på Parafilm.
- Efter åtta minuter av adsorption, veke av en del av provlösningen från provet nätet med en bit filterpapper (skuren i trianglar). Låt inte provet nätet för att torka.
- Tvätta provet nätet i 2 droppar innehållande 10 l respektive MNT buffert för en total tid på 1 minut. Detta görs genom att försiktigt sänka den förlaga rutnät på drop och sedan fuktspridande bort en del av provlösningen från provet nätet med en bit filtrerpapper (utan att låta provet nätet torr).
- Omedelbart efter fuktspridande ut den sista droppen av buffert från provet nätet, komplettly dränka provet nätet inom fläcken droppen och vänta 1 minut.
- Helt veken bort fläcken lösning från provet nätet med en bit filterpapper.
- Låt provet nätet lufttorka i flera minuter innan observation under ett transmissionselektronmikroskop.
Del 6: representativa resultat:
Figur 1
Eftersom influensa A NP (~ 56 kDa) är den största protein som finns i viral ribonucleoprotein komplex, är NP-bandet i allmänhet den starkaste bandet i de fraktioner som innehåller vRNPs (Figur 1). I tillägg till NP, innehåller varje influensa vRNP också en kopia av en trimeric RNA-polymeras (molekylvikt av 82, 86 och 86,5 kDa) komplex. Dessa kan, men inte vara synliga genom Coomassie blå färgning eftersom deras överflöd är låg jämfört med de NP. Den polymeraser, dock kan upptäckas om man istället för en Commassie blånad, ett silver fläck av gelen utförs. Den influensa matrixprotein M1 (~ 28 kDa) bör minimalt närvarande i fraktioner där NP proteinet toppen fraktioner är närvarande.
Figur 2
Negativt-färgade vRNPs som visualiseras i en transmissionselektronmikroskopi ska ge vRNPs som liknar stavformade partiklar med variabel längd som är ca 30 nm till 120 nm i längd (Figur 2a). Den oligomeric NP är organiserad som en kedja av NP molekyler som ytterligare viks in i en dubbel spiral upprepar struktur, så öglor på vardera ändar av dessa stavformade partiklar kan ibland ses (Figur 2b).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Rening av vRNPs bygger på den som beskrivs Kemler et al. (1994). 1 Vi och andra har också använt detta protokoll för att isolera vRNPs att studera deras nukleära import. 2,4,5
Vi rekommenderar användning av RNase-fria tips och tuber när manipulera vRNPs eftersom det virala genomet består av RNA, och därför bryter lätt i närvaro av RNA. Dessutom bör alla buffertar ske i vatten som är RNas gratis. Protokollet som beskrivs här genomfördes med en sur utvinning (t.ex. pH i störningar bufferten och glycerol lutningen är 5,5). På samma sätt kan en grundläggande extraktion utföras (som beskrivs av Kemler et al. (1994) 1) genom att ersätta MES, pH 5,5 med Tris, pH 7,8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats med bidrag från Kanada Foundation for Innovation (CFI), den kanadensiska Institute of Health Research (CIHR) och naturvetenskaplig och teknisk forskning Council of Canada (NSERC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| H3N2 X-31 A/AICHI/68 influenza A | Charles River Laboratories | 490715 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M-8250 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-1 | |
| Octylglucoside | Sigma-Aldrich | O-8001 | |
| Lysolecithin | Sigma-Aldrich | L-4129 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D-9779 | |
| Coomassie brilliant blue G-250 | Kodak | 1367796 | |
| diethyl pyrocarbonate (DEPC)-treated water | Invitrogen | 750024 | |
| Uranyl Acetate | Ted Pella, Inc. | 19481 | |
| Ammonium Molybdate | Fisher Scientific | A-674 | |
| Optima MAX-E Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | 434491 | |
| MLS-50 Rotor Package, Swinging Bucket | Beckman Coulter Inc. | 367280 | |
| TLA-120.2 Rotor Assembly, Fixed-Angle, Titanium | Beckman Coulter Inc. | 362046 | |
| Eppendorf Thermomixer | Lauda Brinkmann | 022670000 |
References
- Kemler, I., Whittaker, G., Helenius, A. Nuclear import of microinjected influenza virus ribonucleoproteins. Virology. 202, 1028-1033 (1994).
- Wu, W. W. H., Weaver, L. L., Panté, N. Ultrastructural analysis of the nuclear localization sequences on influenza a ribonucleoprotein complexes. J Mol Biol. 374, 910-916 (2007).
- Gasteiger, E. The Proteomics Protocols Handbook. Walker, J. M. , Humana Press. 571-607 (2005).
- Wu, W. W. H., Sun, Y. H. B., Panté, Nuclear import of influenza A viral ribonucleoprotein complexes is mediated by two nuclear localization sequences on viral nucleoprotein. Virol J. 4, 49-49 (2007).
- Babcock, H. P., Chen, C., Zhuang, X. Using single-particle tracking to study nuclear trafficking of viral genes. Biophys J. 87, 2749-2758 (2004).
