Summary
פרוטוקול זה מדגים כיצד לבצע אימונוהיסטוכימיה על הזחל תסיסנית גזור.
Abstract
Protocol
לפני שתתחיל
- הכן את הפתרונות הבאים: PBT (0.1% טריטון X100 ב 1X PBS), PBTB (0.2% BSA ב PBT), ו PBTN (NGS 2% PBTB).
- לנתח הזחלים תסיסנית. נא עיין תסיסנית Dissection הזחל NMJ.
אימונוהיסטוכימיה
- הזז את הזחלים כדי צינור 1.5 מ"ל המכיל PBT. שטפו את הזחלים פעמיים במשך 15 דקות ב PBT. הערה: לשטוף, במקום צינור 1.5 מ"ל על מערבל nutator. הסר את הנוזל עם pippetor ולהחליף אותו נוזל טרי.
- הסר את PBT. שטפי ב PBTB פעמיים במשך 30 דקות.
- הסר את PBTB. שטפי ב PBTN פעמיים במשך 15 דקות.
- מדגירים את הנוגדן העיקרי מדולל PBTN ב temp מקום 1 שעה או ב-C º 4 לילה.
- שטפו פעמיים עם PBTB. הערה: לשטוף פתרון להוסיף ולהסיר במהירות.
- לשטוף פעמיים במשך 15 דקות ב PBTB.
- שטפי ב PBTN במשך 30 דקות.
- דגירה של נוגדנים משני (ו נוגדן ראשוני מצומדות אם אתה משתמש אחד) מדולל PBTN.
- מכסים בנייר אלומיניום דגירה עבור 1.5 שעות בטמפרטורת החדר.
- שטפו פעמיים עם PBTB.
- לשטוף פעמיים במשך 15 דקות עם PBTB.
- המשך גובר.
הרכבה
הערה: הר של גליצרול אם דגימות יהיה צילמו מיד. הר זהב ב להאריך אם דגימות יאוחסן לפני הדמיה (עבור יותר משבוע) או אם דגימות חייב להיות צילמו מספר פעמים. כדי להשתמש, במקום בקבוק להאריך באמבט 65 מעלות צלזיוס מים למשך 2-3 דקות. קח aliquot של זהב להאריך ולשמור על הבלוק החום בבית 45-50 º C.
- יוצקים preps מוכתם ב PBT כדי זכוכית שעון.
- שים קצת גליצרול בשקופית זכוכית נקייה לעיבוד.
- העברת בעלי חיים להחליק עיבוד באמצעות בחירת אותם זכוכית השעון על ידי בפינה באמצעות מלקחיים. ודא שהם צד לציפורן למטה.
- הסר את הראש ואת הזנב בסכין גילוח טרי בשקופית עיבוד זכוכית. Exacto סכין עם להב # 16 עובד היטב עבור זה.
- בשקופית נוספת (הרכבה שקופיות), לשים טיפה קטנה של גליצרול / להאריך ולהפיץ אותה עם מלקחיים נקיות.
- העברת בעלי חיים גזור כדי להחליק את הרכבה של קצה שלהם, נזהרת שלא להפוך אותם. נסה לעלות אותם בשורות בכיוון זהה. הר 6-8 חיות לכל שקופית.
- טיפה להחליק לכסות על ידי הצבת יתרון לתוך גליצרול / להאריך ולאט לאט משחררים אותו.
- חותם את השקופית עם מסמר לכה. [הערה אל התמונה עד לכה הוא יבש. זה בדרך כלל לוקח עשר דקות. לקבלת דוגמיות רכוב בזהב להאריך, לתת השקופיות יבש במשך לפחות שלוש שעות לפני איטום או הדמיה.]
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אימונוהיסטוכימיה (IHC) היא חיונית לחקר הביולוגיה NMJ משום שהוא מאפשר הדמיה של NMJ. מטרה זו מושגת על ידי שימוש בנוגדנים המזהים את הממברנה העצבית (למשל, HRP), את presynapse (למשל, CSP, SYT), ו / או postsynapse (למשל, DLG). מולקולות איתות, חלבונים מבניים, או חלבונים רומן עניין גם יכול להיות מוכתם. ואז, יכול להיות גנים שעברו מוטציה או missexpressed ו IHC יכול לזהות ההפרעות של המבנה הסינפטי ו / או איתות עצבי.
NMJ של תסיסנית צברה פופולריות רבה מאז מחקרים מוקדמים שהאיר המבנה הבסיסי שלה לתפקד. 1-4 רבות של מולקולות אשר זוהו במחקרים של NMJ תסיסנית שמורים בתוך החוליות. 4 לכן, תובנות למדו באמצעות מחקרים של NMJ תסיסנית עשויות לחול על הביולוגיה הסינפטי במערכות רבות. כמה יישומים אפשריים כוללים את המחקר של מולקולות מעורב בפיתוח הפלסטיות הסינפטית, מחלות נוירולוגיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope “Stemi” 2000 | Carl Zeiss, Inc. | 495101-9804-000 | |
| Light Source KL 1500 LCD | Carl Zeiss, Inc. | 000000-1063-181 | |
| Dumont SS Forceps | Fine Science Tools | 11200-33 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Adams™ Nutator Mixer | BD Biosciences | 421105 | |
| No.1 Precision knife | X-Acto | 3201 | |
| No. 16 Blades | X-Acto | 216 | |
| ProLong Gold Antifade reagent | Invitrogen | 36930 |
References
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila Melanogaster. J. Physiol. 262, 189-214 (1976).
- Johansen, J., Halpern, M. E., Johansen, K. M., Keshishian, H. Stereotypic morphology of glutamatergic synapses on identified muscle cells of Drosophila larvae. J Neurosci. 9, 710-725 (1989).
- Kesheshian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function. Annu Rev Neurosci. 19, 545-575 (1996).
- Collins, C. A., DiAntonio, A. Synaptic development: insights from Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 17 (1), 35-42 (2007).
