Summary
Ce protocole montre comment effectuer la larve de drosophile immunohistochimie sur disséqués.
Abstract
L'
Protocol
Avant de commencer
- Préparer les solutions suivantes: PBT (0,1% de Triton X100 dans du PBS 1X), PBTB (0,2% de BSA dans PBT), et PBTN (END 2% en PBTB).
- Disséquer larves de drosophile. S'il vous plaît voir la Drosophile larvaire JNM dissection.
L'immunohistochimie
- Déplacer les larves d'un tube de 1,5 ml contenant PBT. Laver les larves à deux reprises pendant 15 minutes dans du PBT. Remarque: pour se laver, placez le tube de 1,5 ml sur une table de mixage nutator. Retirer le liquide avec une pippetor et le remplacer avec du liquide frais.
- Retirez le PBT. Laver à l'PBTB deux fois pendant 30 minutes.
- Retirez le PBTB. Laver à l'PBTN deux fois pour 15 minutes.
- Incuber dans l'anticorps primaire dilué dans PBTN à température ambiante pendant 1 heure ou à 4 º C la nuit.
- Rincer deux fois avec PBTB. Note: pour la solution de rinçage ajouter et supprimer rapidement.
- Laver deux fois pendant 15 minutes dans PBTB.
- Laver à l'PBTN pendant 30 minutes.
- Incuber dans l'anticorps secondaire (anticorps primaire et conjugués si vous en utilisez un) dilué dans PBTN.
- Couvrir de papier d'aluminium et laisser incuber pendant 1,5 heures à température ambiante.
- Rincer deux fois avec PBTB.
- Laver deux fois pendant 15 minutes avec PBTB.
- Procéder au montage.
Montage
Remarque: dans le glycérol Mont si les échantillons seront imagés immédiatement. Mont de prolonger Or, si les échantillons seront stockés avant d'imagerie (pour plus d'une semaine) ou si les échantillons doivent être imagés à plusieurs reprises. Pour l'utiliser, placez une bouteille de prolonger de 65 º C bain-marie pendant 2-3 minutes. Prenez une aliquote de prolonger d'or et de garder sur un bloc de chaleur à 45-50 º C.
- Verser preps colorées en PBT dans un verre de montre.
- Mettez un peu de glycérol sur une lame de verre propre pour le traitement.
- Déplacer les animaux de glisser de traitement en les ramassant sur du verre de montre par un coin à l'aide des pinces. Assurez-vous qu'ils sont côte à cuticules vers le bas.
- Retirez la tête et la queue avec une lame de rasoir frais sur la lame de verre de traitement. Un exacto couteau avec une lame # 16 fonctionne bien pour cela.
- Sur une autre lame (montage de diapositives), mettre une petite goutte de glycérine / prolonger et étalez avec une pince propre.
- Déplacer les animaux disséqués à la diapositive de montage par leur bord, en prenant soin de ne pas les inverser. Essayez de les monter en rangées dans la même orientation. Mont 6-8 animaux par diapositive.
- Déposer une lamelle sur une longueur d'avance en plaçant dans le glycérol / Prolonger et lentement le libérant.
- Sceau de la diapositive avec un vernis à ongles. [Note Ne pas l'image jusqu'à ce que le vernis est sec. Cela prend généralement dix minutes. Pour les échantillons montés dans prolongent en or, laissez-les diapositives sécher pendant au moins trois heures avant d'étanchéité ou d'imagerie.]
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Discussion
L'immunohistochimie (IHC) est vitale pour l'étude de la biologie JNM, car elle permet la visualisation de la JNM. Ceci est accompli en utilisant des anticorps qui reconnaissent la membrane neuronale (par exemple, HRP), l'presynapse (par exemple, CSP, SYT), et / ou le postsynapse (par exemple, DLG). Molécules de signalisation, des protéines de structure, ou de nouvelles protéines d'intérêt peuvent aussi être colorées. Ensuite, les gènes peuvent être mutés ou missexpressed, et IHC peut détecter une perturbation de la structure synaptique et / ou de signalisation neuronale.
Le MNJ de la drosophile a gagné une grande popularité depuis les premières études qui a illuminé de sa structure de base et la fonction. 1-4 Beaucoup de molécules qui ont été identifiés dans les études des JNM drosophile sont conservées chez les vertébrés. 4 Par conséquent, les idées apprises à travers des études de l'JNM drosophile peut être applicable à la biologie synaptique dans de nombreux systèmes. Certaines applications possibles incluent l'étude des molécules impliquées dans le développement synaptique, plasticité, et les maladies neurologiques.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope “Stemi” 2000 | Carl Zeiss, Inc. | 495101-9804-000 | |
| Light Source KL 1500 LCD | Carl Zeiss, Inc. | 000000-1063-181 | |
| Dumont SS Forceps | Fine Science Tools | 11200-33 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Adams™ Nutator Mixer | BD Biosciences | 421105 | |
| No.1 Precision knife | X-Acto | 3201 | |
| No. 16 Blades | X-Acto | 216 | |
| ProLong Gold Antifade reagent | Invitrogen | 36930 |
References
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila Melanogaster. J. Physiol. 262, 189-214 (1976).
- Johansen, J., Halpern, M. E., Johansen, K. M., Keshishian, H. Stereotypic morphology of glutamatergic synapses on identified muscle cells of Drosophila larvae. J Neurosci. 9, 710-725 (1989).
- Kesheshian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function. Annu Rev Neurosci. 19, 545-575 (1996).
- Collins, C. A., DiAntonio, A. Synaptic development: insights from Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 17 (1), 35-42 (2007).
