Summary
このプロトコルは、解剖さショウジョウバエの幼虫の免疫組織化学を実行する方法を示しています。
Abstract
市販
Protocol
あなたが始める前に
- PBT（1X PBS中0.1％トリトンX100）、PBTB（0.2％PBTでBSA）、及びPBTN（PBTBの2％のNGS）：以下の溶液を調製。
- ショウジョウバエの幼虫を解剖。 ショウジョウバエ幼虫NMJの解剖を参照してください。
免疫組織化学
- PBTを含む1.5 mlチューブに幼虫を移動します。 PBTで15分間二回幼虫を洗ってください。注：洗浄するために、nutatorミキサーで1.5 mlチューブを置く。 pippetorで液体を除去し、新鮮な液体でそれを置き換えます。
- PBTを削除します。 30分間二回PBTBで洗浄する。
- PBTBを削除します。 15分間二回PBTNで洗浄する。
- 1時間または一晩4℃で室温でPBTNで希釈した一次抗体でインキュベートする。
- PBTBで二回リンスします。注：追加のソリューションをすすぎ、速やかに削除する。
- PBTBで15分間2回洗浄する。
- 30分間PBTNで洗浄する。
- PBTNで希釈した（とあなたがいずれかを使用している場合標識した1次抗体）を二次抗体でインキュベートする。
- 室温で1.5時間アルミホイルとインキュベートでカバー。
- PBTBで二回リンスします。
- PBTBで15分間2回洗浄する。
- 取り付けに進んでください。
取り付け
注：サンプルはすぐにイメージ化される場合グリセロールでマウント。サンプルを撮像する前に格納される場合（1週間以上にわたって）またはサンプルが複数回撮像する必要がある場合はゴールドを延長するにマウントします。使用するには、2〜3分間65℃の水浴で延ばすのボトルを置きます。ゴールドを延長するのアリコートを取り、45〜50℃でヒートブロック上に保持
- 時計皿にPBTのステンドプレップを注ぐ。
- 処理のためにきれいなガラススライド上に、いくつかのグリセロールを置く。
- 鉗子を使用してコーナーで時計のガラスからそれらを抽出することで処理のスライドに動物を移動する。彼らがダウンしてキューティクル側であることを確認してください。
- 処理のスライドガラス上に新鮮なカミソリの刃で頭と尾を削除します。ブレード＃16 exactoナイフはこのためにうまく機能します。
- 別のスライド（スライドをマウント）で、グリセロール/延長し、清潔なピンセットを用い、それを広めるの小滴を置く。
- それらを反転しないように注意しながら、それらのエッジにより実装スライドに切除した動物を移動します。同じ方向の行にそれらをマウントしてみてください。スライドごとに6月8日の動物をマウントします。
- 延長する/グリセロールに端を置き、ゆっくりとそれを放出することによって上にカバースリップをドロップします。
- マニキュアとスライドをシール。 （注）[ワニスが乾燥するまでイメージしないでください。これは、通常10分かかります。延長させる金にマウントされているサンプルについては、密閉またはイメージを作成する前に、少なくとも3時間のためのスライドを乾燥させる。]
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Discussion
それはNMJの可視化を可能にするため、免疫組織化学（IHC）は、NMJ生物学の研究に不可欠です。これは、神経細胞膜（例えば、HRP）、前シナプス（例えば、CSP、SYT）、および/またはpostsynapse（例えば、DLG）を認識する抗体を使用することによって実現されます。シグナル伝達分子、構造タンパク質、または興味の新規タンパク質も染色することができます。その後、遺伝子が変異またはmissexpressed、およびIHCは、シナプスの構造および/または神経シグナリングの摂動を検出することができますすることができます。
ショウジョウバエのNMJは、その基本構造と機能を点灯初期の研究以来、大きな人気を得ている。1-4 ショウジョウバエ NMJの研究で確認されている分子の多くは脊椎動物で保存されている。4したがって、洞察力は、研究を通して学んだショウジョウバエNMJの多くのシステムにおけるシナプス生物学にも適用可能である。いくつかの可能なアプリケーションでは、シナプスの発達、可塑性、および神経疾患に関与する分子の研究が含まれています。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope “Stemi” 2000 | Carl Zeiss, Inc. | 495101-9804-000 | |
| Light Source KL 1500 LCD | Carl Zeiss, Inc. | 000000-1063-181 | |
| Dumont SS Forceps | Fine Science Tools | 11200-33 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Adams™ Nutator Mixer | BD Biosciences | 421105 | |
| No.1 Precision knife | X-Acto | 3201 | |
| No. 16 Blades | X-Acto | 216 | |
| ProLong Gold Antifade reagent | Invitrogen | 36930 |
References
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila Melanogaster. J. Physiol. 262, 189-214 (1976).
- Johansen, J., Halpern, M. E., Johansen, K. M., Keshishian, H. Stereotypic morphology of glutamatergic synapses on identified muscle cells of Drosophila larvae. J Neurosci. 9, 710-725 (1989).
- Kesheshian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function. Annu Rev Neurosci. 19, 545-575 (1996).
- Collins, C. A., DiAntonio, A. Synaptic development: insights from Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 17 (1), 35-42 (2007).
