Summary
Этот протокол свидетельствует о том, как выполнить иммуногистохимии на расчлененный личинки дрозофилы.
Abstract
Protocol
Перед тем как начать
- Подготовьте следующие решения: PBT (0,1% Triton X100 в 1X PBS), PBTB (0,2% BSA в PBT) и PBTN (2% в PBTB NGS).
- Рассеките дрозофилы личинок. Пожалуйста, смотрите дрозофилы личинок NMJ Dissection.
Иммуногистохимия
- Перемещение личинок 1,5 мл пробирку PBT. Вымойте личинки дважды за 15 минут в PBT. Примечание: для стирки, места 1,5 мл трубки на nutator смесителя. Удалите жидкость с pippetor и заменить его свежей жидкостью.
- Удалить PBT. Стирать в PBTB два раза в течение 30 минут.
- Удалить PBTB. Стирать в PBTN два раза в течение 15 минут.
- Инкубируйте в первичных антител разводят в PBTN при комнатной температуре в течение 1 часа или при температуре 4 º С в течение ночи.
- Промыть два раза PBTB. Примечание: для полоскания добавить раствор и удалите быстро.
- Мыть два раза в течение 15 минут в PBTB.
- Стирать в PBTN течение 30 минут.
- Инкубируйте в вторичными антителами (и сопряженных первичных антител, если вы используете один) разводят в PBTN.
- Крышка из фольги и инкубировать в течение 1,5 часа при комнатной температуре.
- Промыть два раза PBTB.
- Мыть два раза в течение 15 минут с PBTB.
- Приступить к установке.
Монтаж
Примечание: Гора в глицерине, если образцы будут отображаемого сразу. Горы в Продли Золотой если образцы будут храниться до томографии (более недели), или если образцы должны быть отображены несколько раз. Для использования, место бутылку продлить на 65 ° С водяной бане в течение 2-3 минут. Возьмите аликвоту Продли золото и держать в на тепло-блок на 45-50 º C.
- Налейте окрашенный подготавливает в PBT в к часовым стеклом.
- Поместите немного глицерина на чистое предметное стекло для обработки.
- Перемещение животных на обработку слайдов, выбирая их из часовым стеклом на углу использованием щипцов. Убедитесь, что они являются кутикулы стороной вниз.
- Удалите головы и хвоста с новым лезвием на слайде обработки стекла. Exacto-нож с лезвием № 16 работает хорошо для этого.
- С другой слайд (монтаж слайд), положить небольшую каплю глицерина / продлить и распространить ее чистой щипцами.
- Перемещение расчлененный животных монтаж слайд их края, заботясь, чтобы не инвертировать их. Попробуйте подключить их в ряды в той же ориентации. Горы 6-8 животных на слайде.
- Оставьте покровным стеклом, поставив на край в глицерин / Продли и медленно отпуская ее.
- Печать слайдов с лаком для ногтей. Примечание [Не изображение, пока лак высохнет. Это обычно занимает десять минут. Для образцов установлены в продлении золото, слайды высохнуть в течение по крайней мере за три часа до запечатывания или изображений.]
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Иммуногистохимии (IHC) имеет жизненно важное значение для изучения NMJ биологии, поскольку она позволяет визуализировать NMJ. Это достигается с помощью антител, которые распознают нейронной мембраны (например, HRP), presynapse (например, CSP, SYT), и / или postsynapse (например, DLG). Сигнальных молекул, структурных белков, или новых белков интерес может также быть окрашены. Затем, гены могут быть мутировал или missexpressed и IHC может обнаружить возмущение синаптической структуре и / или нейронных сигналов.
NMJ дрозофилы приобрел большую популярность с начала исследования, освещенные его основные структуры и функции. 1-4 Многие из молекул, которые были выявлены в исследованиях Drosophila NMJ сохраняются у позвоночных. 4 Таким образом, идеи, извлеченные в ходе исследования из Drosophila NMJ могут быть применимы к синаптической биологии во многих системах. Некоторые возможные применения включают в себя изучение молекул, участвующих в синаптической развития, пластичность и неврологических заболеваний.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope “Stemi” 2000 | Carl Zeiss, Inc. | 495101-9804-000 | |
| Light Source KL 1500 LCD | Carl Zeiss, Inc. | 000000-1063-181 | |
| Dumont SS Forceps | Fine Science Tools | 11200-33 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Adams™ Nutator Mixer | BD Biosciences | 421105 | |
| No.1 Precision knife | X-Acto | 3201 | |
| No. 16 Blades | X-Acto | 216 | |
| ProLong Gold Antifade reagent | Invitrogen | 36930 |
References
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila Melanogaster. J. Physiol. 262, 189-214 (1976).
- Johansen, J., Halpern, M. E., Johansen, K. M., Keshishian, H. Stereotypic morphology of glutamatergic synapses on identified muscle cells of Drosophila larvae. J Neurosci. 9, 710-725 (1989).
- Kesheshian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function. Annu Rev Neurosci. 19, 545-575 (1996).
- Collins, C. A., DiAntonio, A. Synaptic development: insights from Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 17 (1), 35-42 (2007).
