Summary
Este protocolo muestra cómo realizar técnicas de inmunohistoquímica sobre disecados larvas de Drosophila.
Abstract
La
Protocol
Antes de empezar
- Prepare las siguientes soluciones: PBT (0,1% Triton X100 en PBS 1X), PBTB (0,2% de BSA en PBT), y PBTN (NGS 2% en PBTB).
- Diseccionar las larvas de Drosophila. Por favor vea las larvas de Drosophila disección NMJ.
Inmunohistoquímica
- Mueva las larvas de un tubo de 1.5 ml contiene PBT. Lavado de las larvas de dos veces durante 15 minutos en el PBT. Nota: para lavar, se coloca el tubo de 1.5 ml en un mezclador nutator. Quite el líquido con una pippetor y reemplazarlo con líquido fresco.
- Retire el PBT. Lavar dos veces en PBTB durante 30 minutos.
- Retire la PBTB. Lavar dos veces en PBTN durante 15 minutos.
- Se incuban en anticuerpo primario diluido en PBTN a temperatura ambiente durante 1 hora o menos 4 º C durante la noche.
- Aclarar dos veces con PBTB. Nota: para la solución de enjuague agregar y quitar rápidamente.
- Lavar dos veces durante 15 minutos en PBTB.
- Lave en PBTN durante 30 minutos.
- Se incuban en anticuerpo secundario (anticuerpo conjugado primaria y si usted está usando una) diluido en PBTN.
- Cubierta en papel de aluminio e incubar durante 1,5 horas a temperatura ambiente.
- Aclarar dos veces con PBTB.
- Lavar dos veces durante 15 minutos con PBTB.
- Proceder al montaje.
Montaje
Nota: Monte en glicerol si las muestras se creará una imagen de inmediato. Monte de Oro prolongar si las muestras se almacenan antes de exponer (por más de una semana) o si las muestras deben ser reflejados en múltiples ocasiones. Para utilizarlo, coloque una botella de prolongar en el 65 º baño de agua C durante 2-3 minutos. Tomar una alícuota de prolongar Oro y mantenerse en calor en un bloque a 45-50 º C.
- Vierta preparaciones teñidas en PBT en un vidrio de reloj.
- Ponga un poco de glicerina en un portaobjetos de vidrio limpio para su procesamiento.
- Trasladar a los animales para deslizar el procesamiento por recogerlos del vidrio de reloj en una esquina con unas pinzas. Asegurarse de que están de lado la cutícula hacia abajo.
- Quitar la cabeza y la cola con una hojita de afeitar nueva en el portaobjetos de vidrio procesado. Un exacto cuchillo con la hoja n. º 16 funciona bien para esto.
- En otra diapositiva (slide de montaje), poner una pequeña gota de glicerol / prolongar y extender con pinzas limpias.
- Trasladar a los animales disecados de la diapositiva de montaje en su borde, teniendo cuidado de no invertir. Intente montarlos en las filas de la misma orientación. Monte 8.6 animales por diapositiva.
- Caída de una hoja de cubierta mediante la colocación de una ventaja en el glicerol / Prolongar y poco a poco la liberación.
- Sello de la diapositiva con esmalte de uñas. [Nota No imagen hasta que el barniz se seca. Esto suele tardar diez minutos. Para las muestras montadas en prolongar oro, que las diapositivas se seque por lo menos tres horas antes de sellar o de imagen.]
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Discussion
Inmunohistoquímica (IHC) es de vital importancia para el estudio de la biología MNJ, ya que permite la visualización de la UNM. Esto se logra mediante el uso de anticuerpos que reconocen la membrana neuronal (por ejemplo, HRP), la presynapse (por ejemplo, CSP, SYT), y / o la postsynapse (por ejemplo, DLG). Moléculas de señalización, las proteínas estructurales, o de nuevas proteínas de interés también puede ser manchada. Entonces, los genes pueden mutar o missexpressed y IHC puede detectar la perturbación de la estructura sináptica y / o de señalización neuronal.
La NMJ de Drosophila ha ganado gran popularidad desde los primeros estudios que iluminó su estructura y las funciones básicas. 1.4 Muchas de las moléculas que han sido identificados en los estudios de la Drosophila NMJ se conservan en los vertebrados. 4 Por lo tanto, las ideas aprendidas a través de estudios de la Drosophila NMJ puede ser aplicable a la biología sináptica en muchos sistemas. Algunas aplicaciones posibles incluyen el estudio de moléculas implicadas en el desarrollo sináptico, la plasticidad y la enfermedad neurológica.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope “Stemi” 2000 | Carl Zeiss, Inc. | 495101-9804-000 | |
| Light Source KL 1500 LCD | Carl Zeiss, Inc. | 000000-1063-181 | |
| Dumont SS Forceps | Fine Science Tools | 11200-33 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Adams™ Nutator Mixer | BD Biosciences | 421105 | |
| No.1 Precision knife | X-Acto | 3201 | |
| No. 16 Blades | X-Acto | 216 | |
| ProLong Gold Antifade reagent | Invitrogen | 36930 |
References
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila Melanogaster. J. Physiol. 262, 189-214 (1976).
- Johansen, J., Halpern, M. E., Johansen, K. M., Keshishian, H. Stereotypic morphology of glutamatergic synapses on identified muscle cells of Drosophila larvae. J Neurosci. 9, 710-725 (1989).
- Kesheshian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function. Annu Rev Neurosci. 19, 545-575 (1996).
- Collins, C. A., DiAntonio, A. Synaptic development: insights from Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 17 (1), 35-42 (2007).
