Summary
이 프로토콜은 해부 Drosophila의 유충에 immunohistochemistry을 수행하는 방법을 보여줍니다.
Abstract
Protocol
당신이 시작하기 전에
- 다음과 같은 솔루션을 준비 : PBT (1X PBS에 0.1 %의 트리톤의 X100), PBTB (0.2 % PBT에서 BSA) 및 PBTN (PBTB에서 2 % NGS)을.
- Drosophila의 유충을 해부하다. Drosophila 애벌레 NMJ의 절개를 참조하십시오.
Immunohistochemistry
- PBT를 포함하는 1.5 ML 튜브에 애벌레로 이동합니다. PBT에서 15 분 동안 두 번 애벌레를 씻으십시오. 참고 : 세척하는 nutator 믹서에 1.5 ML 튜브를 놓습니다. pippetor와 액체를 제거하고 신선한 액체로 대체합니다.
- PBT를 제거합니다. 30 분 두 번 PBTB로 씻으십시오.
- PBTB를 제거합니다. 15 분 동안 두 번 PBTN로 씻으십시오.
- 1 시간 또는 밤새 4 º C에서 온도는 실온에서 PBTN에 희석 일차 항체에 품어.
- PBTB로 두 번 씻어. 참고 : 추가적인 솔루션을 씻어 신속하게 제거하실 수 있습니다.
- PBTB에서 15 분 동안 두 번 씻으십시오.
- 30 분 PBTN로 씻으십시오.
- PBTN에 희석 보조 항체 (그리고 하나를 사용하는 경우에는 복합 기본 항체)에 품어.
- 상온에서 1.5 시간 동안 석박과 부화에 커버.
- PBTB로 두 번 씻어.
- PBTB와 함께 15 분 동안 두 번 씻으십시오.
- 설치를 진행합니다.
설치
참고 : 샘플은 즉시 몇 군데가 될 수 글리세롤에 마운트합니다. 샘플 이미징 전에 저장됩니다 경우 (일주일 이상) 또는 시료가 여러 번 몇 군데해야하는 경우 골드 연장에 탑재합니다. 사용하려면, 2-3 분 동안 65 º C의 물을 욕조에 연장의 병을 넣으십시오. 골드 연장의 나누어지는를 타고 45-50 º C.에 열을 블록에 유의
- 시계 유리에 PBT의 스테인드 preps 하거라.
- 처리를위한 깨끗한 유리 슬라이드에 일부 글리세롤 놔.
- 포셉을 사용하여 모서리로 시계 유리의 그들을 채취하여 처리 슬라이드로 동물을 이동합니다. 그들은 아래 표피 사이드 있도록.
- 가공 유리 슬라이드에 신선한 면도날로 머리와 꼬리를 제거합니다. 블레이드 # 16과 함께 exacto - 칼로이 일을 잘 작동합니다.
- 다른 슬라이드에 (슬라이드를 장착), 글리세롤의 작은 방울을 넣어 / 청소 집게로 연장하고 확산.
- 그들을 반대로하지 돌보는 그들의 가장자리에 의해 장착 슬라이드를 해부 동물을 이동합니다. 같은 방향으로 행에서 그들을 탑재하려고. 슬라이드마다 6-8 동물을 탑재합니다.
- 연장 / 글리세롤에 우위를 넣어 천천히 그것을 출시하여 표지 용지를 놓습니다.
- 손톱 광택과 슬라이드를 밀봉합니다. 참고 [니스가 마른 때까지 이미지를하지 마십시오. 이것은 일반적으로 10 분 걸립니다. 연장 황금 장착 샘플, 밀폐 또는 영상 이전에 최소한 세 시간은 슬라이드를 건조하게.]
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Discussion
그것은 NMJ의 시각화를 가능하게하기 때문에 Immunohistochemistry (IHC)는 NMJ 생물학 연구를위한 중요합니다. 이것은의 연결 멤브레인 (예 : HRP), presynapse (예 : CSP, SYT), 및 / 또는 postsynapse (예 : DLG)를 인식 항체를 사용하여 수행됩니다. 신호 분자, 구조 단백질, 또는 관심있는 소설 단백질도 얼룩 수 있습니다. 그렇다면 유전자가 변이된 또는 missexpressed하고, IHC는 시냅스 구조 및 / 또는의 연결 신호의 섭동를 검색할 수 있습니다.
Drosophila의 NMJ는 기본 구조와 기능을 조명 초기 연구부터 큰 인기를 얻고있다. 1-4은 Drosophila NMJ 연구에서 확인된 분자의 대부분은 척추 동물에 보존되어있다. 4 따라서, 통찰력이 연구를 통해 배운 Drosophila NMJ 많은 시스템에서 신경 생물학에 적용됩니다. 몇 가지 응용 프로그램은 시냅스 개발, 소성, 그리고 신경 질환에 관련된 분자의 연구를 포함합니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope “Stemi” 2000 | Carl Zeiss, Inc. | 495101-9804-000 | |
| Light Source KL 1500 LCD | Carl Zeiss, Inc. | 000000-1063-181 | |
| Dumont SS Forceps | Fine Science Tools | 11200-33 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Adams™ Nutator Mixer | BD Biosciences | 421105 | |
| No.1 Precision knife | X-Acto | 3201 | |
| No. 16 Blades | X-Acto | 216 | |
| ProLong Gold Antifade reagent | Invitrogen | 36930 |
References
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila Melanogaster. J. Physiol. 262, 189-214 (1976).
- Johansen, J., Halpern, M. E., Johansen, K. M., Keshishian, H. Stereotypic morphology of glutamatergic synapses on identified muscle cells of Drosophila larvae. J Neurosci. 9, 710-725 (1989).
- Kesheshian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function. Annu Rev Neurosci. 19, 545-575 (1996).
- Collins, C. A., DiAntonio, A. Synaptic development: insights from Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 17 (1), 35-42 (2007).
