Summary
여기 Drosophila의 유충의 신경근육학 교차점에서 시냅스 전송을 측정 electrophysiological 방법을 설명합니다. Evoked 릴리스는 모터 신경의 axons을 자극하여 인공적으로 시작되며, NMJ을 통해 전송은 근육에 evoked postsynaptic 반응에 의해 측정할 수 있습니다.
Abstract
이 비디오에서는, 우리는 Drosophila의 유충의 신경근육학 교차점 (NMJ)에서 신경 전달 기록에 대한 electrophysiological 방법을 설명합니다. 애벌레 신경근육학 시스템은 시냅스 생리학과 neurotransmission 연구를위한 모델 버렸네이며, 유전학을 정의하고 실험 조작에 액세스할 수있는 가치있는 연구 도구입니다. 애벌레는 몸을 벽 근육, 중추 신경계 및 말초 신경을 노출 해부하실 수 있습니다. Drosophila과 innervation 패턴의 근육이 잘 특징과 근육 세포 기록에 대한 액세스하기 쉽습니다. A7 - 개인 근육은 8 복부 세그먼트, 세그먼트에서 A2를 반복하는 패턴으로 배열된 30 근육과 각 내에 위치와 방향에 의해 확인할 수 있습니다. 해부 drosophila의 애벌레가 얇고 개인 근육과 운동 신경의 axons의 번들하는 것은 transillumination하여 시각 수 있습니다
Protocol
시작하기 전에 준비 :
- 완더링 yhird instar Drosophila의 애벌레
- HL3.1 (hemolymph 같은 수정된) 솔루션
- Sylgard (투명 실리콘 고무) 해부 접시는 브렌트와 맥케 이브 (2008) 3 설명한 방법을 사용하여 소형 (35 × 10 ㎜) 플라스틱 배양 접시에 준비했습니다.
- 해부 핀 짧은 컷
- 전극 pipettes을 자극
- 샤프 기록 pipettes
HL3 솔루션 :
- 70 NaCl, 5 KCl, 4 MgCl 2, 10 NaHCO 3, 5 trehalose, 115 자당, 5 HEPES, pH를 7.2 : 해부 및 electrophysiological 실험 동안, 유충은 (MM)를 포함하고 HL3.1 솔루션 2 열중하고 있습니다.
- CaCl 2의 농도는 세포 칼슘 2 +의 필요한 농도를 제공하는 HL3.1 솔루션에 추가됩니다.
- 애벌레 해부는 HL3.1를 사용하여 + 농도 (근육 수축을 피하기 위해) + 0.25 MM CaCl 2, 얼음에 보관 낮은 칼슘 2 수행됩니다.
- Electrophysiological 실험은 일반적으로 HL3.1에 기록됩니다 + 1 ㎜ CaCl 2, 그러나 이것은 0.4에서 조정할 수 있습니다 - 1 MM 칼슘 2 +로 필요합니다.
- HL3.1 솔루션은 필터를 사용하기 전에 소독, 4에 저장된 ˚ C.
pipettes을 자극하고 기록 준비 :
- 열 = 390, 필라멘트 = 4, 속도 = 35 = 200 지연과 = 0 당겨 :. 녹화 및 자극 pipettes은 다음과 같은 설정을 사용하여 셔터 P - 2000 레이저 기반 micropipette의 풀러와 함께 행진
- 자극 전극은 절단 모터 axons의 넓이보다 약간 크게되었습니다 넓은 끝을 가진 얇은 벽으로 둘러싸인 borosilicate 유리 모세관의 준비가되어 있습니다. 모양 엔드는 신경 손상을 최소화하기 위해 부드러운 마무리 (Narashiga 피펫 폴리셔 사용), 줄 firepolished 있습니다. 자극 전극 목욕 솔루션 (HL3.1 + 1 ㎜ 칼슘 2 +)로 채워진다.
- 기록 전극은 날카로운 피펫 (MΩ 30-60)를 형성 냈고, 3M KCl으로 가득 1.2mm borosilicate 유리에서 준비가되어 있습니다.
1 부 : Drosophila의 애벌레의 해부
- 제 instar 방황 애벌레는 이전에 다음 ID로 4 설명된대로 몸을 벽의 근육을 폭로 해부하고 있습니다.
- 해부는 HL3.1에서 수행됩니다 + 0.25 MM 칼슘 2 + 작은 실리콘 접시에 (35 X 10mm). HL3.1 솔루션은 유충을 마취시키다하기 위해 해부를위한 얼음처럼 차가운해야하며, 해부 전과 도중 얼음에 보관됩니다.
- 애벌레는 HL3.1 해부 솔루션 + 0.25 MM에게 칼슘 2 추가 및 적고 짧은 절개 핀을 (~ 2mm 길이)를 사용하여 전기 생리학 실험에 대한 수정 브렌트와 맥케 이브 (2008)에 의해 설명된 방법을 사용 해부 아르 실험 기간 동안 현미경의 객관적이고 전극에 충돌 가능성.
- 해부 다음, 애벌레의 모터 axons이 절단됩니다. 이것은 부드럽게 CNS를 개최하고 복부 신경절에 후부 근육 신경을 분포시키다 주변 신경이 근육 (그림 1)을 손상하지 않고 컷 수 있도록 약간을 높이는 통해 이루어집니다. 두뇌 뺍니다.
- 해부 애벌레 준비는 HL3.1로 두 번 씻은 있습니다 + 1 ㎜ 칼슘 2 +합니다.
그림 1. 해부 애벌레의 모터 axons 절단에 관련된 단계를 보여주는 도식. CNS는 집게와 함께 해제되고 모터 axons은 뇌의 바닥에 그만입니다.
2 부 : 애벌레 근육 세포에서 세포내 기록.
- 전기 생리학 현미경과 잠수함 HL3.1과 준비에 대한 해부 접시 + 1.5 MM 칼슘 2 +를 삽입하고 용액과 접촉되도록 욕조 전극을 수정.
- 모든 실험은 세 번째 복부 세그먼트 (A3) 이내에 근육 6 수행됩니다. 근육 신경을 분포시키다 주변 신경은 흡입 전극 5를 사용하고 자극하고 있습니다.
- 세포내 전극이 자리에있을 때 진동을 피하기 위해 먼저 접시에 자극 전극을 위치. 근육 6 innervating 모터 신경에 가까운 주변에 자극 전극을 놓고 컷 신경이 유리 피펫 안에 때까지 부드럽게 흡입을 적용합니다. 흡입이 적용되면 신경을 스트레칭하지 않도록주의하십시오. 약간 그래서 그것이 그렇게 그것이 절단 신경 섬유 (그림 2)에 당기하지 않는 근육과 위치를 만지지 않아 피펫을 올립니다.
그림 2. Drosophila의 유충에서 한 복부 세그먼트의 근육과 innervating 모터 뉴런의 구조. 근육 6 위치에 자극 피펫 및 절단 신경 및 기록 전극의 위치는 그림입니다. - 인트라휴대폰 녹음 3 M KCl로 가득 날카로운 microelectrodes로 만들어집니다. 세 번째 복부 세그먼트 (A3)에 근육 6 중심 위의 기록 전극을 위치하고 목욕 솔루션 제로 읽기 때문에 오프셋 입력을 조정합니다. 천천히 전극을 절감하고 그것이 근육 표면을 접촉까지 높은 광학 배율 아래에있는 근육에 접근한다. 근육이 침투되었는지 확인하기 위해 오실로 스코프를보세요. 쉬고 막 가능성은 적어도 -60 MV해야하거나 동물을 사용해서는 안됩니다. 산발적 미니어처 endplate의 잠재력은 이제 볼 수 있습니다. 기록 시작하기 전에 일분 안정화하기 위해 세포를 남겨주세요.
- 멤브레인 전위의 변화는 액슨 HS - 2A 헤드 무대와 Axoclamp 2B 증폭기로 감지하고 Clampex V 8.2.0.235 (액슨 인 스트 루먼트)로 기록됩니다. Axoclamp의 2B는 pCLAMP 소프트웨어와 Digidata 1322A 인터페이스와 함께 작동을 실행하는 컴퓨터에 인터페이스입니다.
- 세포 mEJP 반응을 측정하기 위해 어떤 자극없이 3 분 녹음되었습니다. 성분은 미니 분석 소프트웨어 (Synaptosoft, V 6.0.3)와 결정 mEJP 진폭과 주파수를 사용하여 분석했다.
신경 자극 :
- 모터 신경의 절단 부분이 전체 근육의 지속적인 반응을 보여주고을 모두 모터 axons에 대한 충분한 강도의 제곱 전압 펄스 (0.3 MS 기간)의 일련의 자극이다.
- 자극은 기간 및 간격 시간에 따라 연속적으로 펄스를 제공하는 프로그램입니다 마스터 - 8 펄스 발생기와 함께 생성됩니다.
- NMJ에서 시냅스 복구를 위해 자극 사이에 가는데 허용합니다.
- 자극의 강도를 결정할 때, 가장 낮은 수준으로 시작하여 여러 실험을 통해 천천히 강도를 증가시킵니다. evoked 응답 결과 최소 자극 강도는 실험에 사용해야합니다.
- 적절한 자극 강도에 도달하면 하나의 복합 EJP과 자극에 의해 evoked 한 근육 수축이 있어야합니다.
- 각 근육 평균 amplitudes에서 적어도 10 evoked 잠재력을 기록합니다.
파트 3 : 대표 결과
그림 3. evoked EJP의 근육을 보여주는 6 대표 세포 녹화 segmental 신경의 전기 자극, 그리고 산발적 미니어처 endplate의 잠재력, 또는 mEJP의에 응답합니다. 같은 캔턴 S와 같은 건강한 야생 형 애벌레의 근육 6 EJP amplitudes는 일반적으로 40 뮤직 비디오와 1-3 MV 사이 mEJP amplitudes 수 있습니다.
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Discussion
방법은 NMJ에서 시냅스 기능의 변화를 감지하기 위해 상대적으로 신속하고 광범위한 방법을 제공합니다 여기에서 설명한. 생체내 그대로 동물을 사용하여 electrophysiological 레코딩을 수행하고, 유전이나 약리 조작을 수행할 수있는 능력, Drosophila neurotransmission의 생리 및 유전적 측면을 조사하는 데 이상적인 동물 모델 확인하십시오.
근육 세포가 매우 큰 때문에, 일부는 두 전극 전압 클램프 (TEVC) 녹음이 프로토콜에 대한 추가 단계를 추가하는 것을 선호 수도 있습니다. 이것은 세포에 전류 통과 전극을 위치하여 장소에서 세포내 전극과 같은 애벌레 준비에 수행할 수 있습니다. 세포가 충분히 채워 전압되면, 현재 응답이 기록될 수 있습니다.
근육 6 가장 일반적으로 전기 생리학 레코딩에 사용되지만, 근육 7 12도 사용할 수 있습니다.
방법은 Drosophophila NMJ 전기 생리학의 기초 보여 여기에 설명된 - 먼저 1976 1월 및 월에 의해 설명되었다 기술하고, 이후 신경 생리학 연구를위한 모델 시스템이되고 있습니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small Petri dishes (35 x 10 mm) | BD Biosciences | 1008 | |
| SYLGARD 182 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 3097366-1004 | |
| Dissecting microscope | Carl Zeiss, Inc. | 475002-9902 | |
| Light for microscope | Schott AG | KLI500 | |
| Dissection pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| pClamp 9 software | Molecular Devices | PCLAMP 9 STANDARD | |
| Dissection scissors: 3mm Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-0 | |
| Dumont SS Forceps | Fine Science Tools | 11200-33 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Thin-walled borosilicate glass capillaries, with filament (1.0 mm, 4 in) | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-4 | |
| Borosilicate glass capillaries, with filament (1.2 mm, 4 in) | World Precision Instruments, Inc. | 1B120F-4 | |
| Sutter P-2000 Laser Based Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | Model P-2000 | |
| Pipette polisher | Narishige International | MF-83 | |
| Axon HS-2A head stage | Molecular Devices | Model HS-2A | |
| Micromanipulators | Sutter Instrument Co. | MP-85 | |
| Axoclamp 2B amplifier | Molecular Devices | AXOCLAMP 2B | |
| Clampex Software | Molecular Devices | v 8.2.0.235 | |
| Mini analysis software. v 6.0.3 | Synaptosoft | ||
| Brownlee Precision Amplifier | Brownlee | Model 410 | |
| NaCl | Baker/VWR | 4058-01 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | p-9333 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | s6297-1kg | |
| Trelahose | Sigma-Aldrich | TO167 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | bp220-212 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | h-3375 | |
| MgCl-6H2O | Sigma-Aldrich | m2670-1kg | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | c79-500 | |
| Master-8 Pulse Generator | A.M.P.I | ||
| Vibration table for electrophysiology set up | Technical Manufacturing Corp. | ||
| Faraday Cage |
References
- Atwood, H. L., Govind, C. K., Wu, C. F. Differential ultrastructure of synaptic terminals on ventral longitudinal abdominal muscles in Drosophila larvae. J. Neurobiol. 24 (8), 1008-1024 (1993).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).
- Estes, P. S., Roos, J., van der Bliek, A., Kelly, R. B., Krishnan, K. S., Ramaswami, M. Traffic of dynamin within individual Drosophila synaptic boutons relative to compartment-specific markers. J Neurosci. 16, 5443-5456 (1996).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Protocol for dissection of Drosophila larvae. J Vis Exp. , (2008).
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster. J Physiol (Lond). 262, 189-214 (1976).
- Katz, L. C., Shatz, C. J. Synaptic activity and the construction of cortical circuits. Science. 274, 1133-1138 (1996).
