Summary
Här beskriver vi elektrofysiologiska metoder för att mäta synaptiska transmissionen i den neuromuskulära förbindelsen för Drosophila larv. Frammanade släppa initieras artificiellt genom att stimulera motoriska neuron axoner, och överföring via NMJ kan mätas genom den postsynaptiska svaret väckte i muskeln.
Abstract
I denna video beskriver vi elektrofysiologiska metoder för inspelning synaptiska transmissionen i den neuromuskulära synapsen (NMJ) på Drosophila larv. Den larver neuromuskulära systemet är en modell synaps för studier av synaptiska fysiologi och neurotransmission, och är ett värdefullt forskningsverktyg som har definierat genetik och är tillgänglig för experimentell manipulation. Larver kan dissekeras att exponera kroppen väggen muskulatur, centrala nervsystemet och perifera nerver. Musklerna i Drosophila och deras innervation mönster är väl karakteriserade och muskler är lätta att komma åt för intracellulära inspelning. Enskilda muskler kan identifieras genom deras placering och orientering inom 8 buken segment, varje med 30 muskler arrangerade i ett mönster som upprepas i segment A2 - A7. Dissekerade Drosophila larver är tunna och enskilda muskler och buntar av motoriska neuron axoner kan visualiseras genom genomlysning
Protocol
Innan du börjar förbereda:
- Wandering yhird INSTAR bananfluga larver
- HL3.1 (Ändrad hemolymph-liknande) lösning
- Sylgard (genomskinlig silikongummi) dissektion plattor upprättats i små (35 x 10 mm) petriskålar av plast med metoder som beskrivs av Brent och McCabe (2008) 3.
- Skär dissektion stift kort
- Stimulerande elektrod pipetter
- Sharp inspelning pipetter
HL3 Lösning:
- Under dissektioner och elektrofysiologiska experiment, är larv nedsänkt i HL3.1 lösning 2 som innehåller (i mm): 70 NaCl, 5 KCl, 4 MgCl 2, 10 NaHCO 3, 5 trehalos, 115 sackaros och 5 HEPES, pH 7,2.
- Halterna av CaCl 2 läggs till HL3.1 lösningen att tillhandahålla den nödvändiga koncentrationen av extracellulärt Ca 2 +.
- Larver dissektioner utförs vid låga Ca 2 + koncentrationen (för att undvika muskelkontraktion) med HL3.1 + 0,25 mM CaCl 2, höll på is.
- Elektrofysiologiska experimenten är vanligtvis registreras i HL3.1 + 1 mM CaCl 2, men detta kan justeras från 0,4 till 1 mM Ca 2 + som krävs.
- Den HL3.1 Lösningen är filtret steriliseras före användning och lagras vid 4 ˚ C.
Beredning av stimulerande och inspelning pipetter:
- Inspelning och stimulerande pipetter dras med en Sutter P-2000 laserbaserade mikropipett avdragare med hjälp av följande inställningar: Värme = 390, Filament = 4, hastighet = 35, Delay = 200 och Pull = 0.
- Stimulerande elektroder framställs av tunnväggiga borosilikatglas kapillärer med breda ändar, som var något större än bredden på den avskurna motoriska axoner. Den formade ändarna firepolished att ge en jämn yta (med hjälp av en Narashiga pipett polermaskin), för att minimera skador på nerven. Stimulerande elektroder är fyllda med bad lösning (HL3.1 + 1 mm Ca 2 +).
- Inspelningen elektroderna är beredda från 1,2 mm borosilikatglas, som dras för att bilda en skarp pipett (30-60 Mohm), och fylld med 3M KCl.
Del 1: dissekering av Drosophila Larver
- Tredje INSTAR vandrande larver dissekeras att exponera muskler i kroppen väggen som tidigare beskrivits 4.
- Dissektioner utförs i HL3.1 + 0,25 mM Ca 2 + på små silikon plattor (35 x 10 mm). HL3.1 lösningen måste vara iskall för dissektioner för att söva ner larven, och hålls på is före och under dissektioner.
- Larverna är dissekeras med metoder som beskrivs av Brent och McCabe (2008), som är modifierad för elektrofysiologi experiment genom att lägga till 0,25 mm Ca 2 + till HL3.1 dissekering lösningen, och med korta dissektion stift (~ 2 mm lång) som är mindre sannolikt att slå mikroskop mål och elektroder under ett experiment.
- Efter dissektion är motorn axoner av larver avskurna. Detta görs genom att försiktigt hålla CNS och höja den lite så den perifera nerver som innerverar muskler posteriort om ventrala ganglion kan kapas utan att skada musklerna (Figur 1). Hjärnan tas sedan bort.
- Den dissekerade larver preparatet tvättas två gånger med HL3.1 + 1 mm Ca 2 +.
Figur 1. Schematisk som visar de olika stegen i skär motorn axoner av dissekeras larver. CNS lyfts med pincett och motorn axoner skärs vid basen av hjärnan.
Del 2: Intracellulär inspelningar från larver muskelceller.
- Placera dissektion plattan på elektrofysiologi mikroskop och dränka prep med HL3.1 + 1,5 mm Ca 2 + och fixa badet elektroden så det är i kontakt med lösningen.
- Alla experiment utförs på muskel-6 inom den tredje abdominal-segmentet (A3). Perifera nerver som innerverar musklerna stimuleras med hjälp av en sug elektrod 5.
- Placera stimulerande elektrod i skålen först för att undvika vibrationer när den intracellulära elektroden på plats. Placera stimulerande elektroden i närhet till motorneuronen innervating muskel 6 och försiktigt sug tills skär nerven är inne i glaspipett. Var noga med att inte tänja på nerverna när sug tillämpas. Höj pipetten aning så att den inte kommer i kontakt med muskeln och placera den så att den inte drar på snittet nervtrådarna (Figur 2).
Figur 2. En schematisk av muskulaturen och innervating motorneuronen av en buk segment från Drosophila larv. Placeringen av stimulerande pipett och avskurna nerver och inspelningen elektroden på plats vid muskel 6 illustreras. - Intracellulära inspelningar är gjorda med skarpa microelectrodes fyllda med 3 M KCl. Placera inspelningen elektroden ovanför centrum av muskeln 6 på tredje abdominal-segmentet (A3) och justera in offset så att den läser noll för badet lösningen. Långsamt sänka elektroden och förhållningssätt i muskeln under hög optisk förstoring tills det når muskeln ytan. Titta på oscilloskopet för att bekräfta att muskeln har penetrerats. Den vilar membranpotential bör vara minst -60 mV, eller djuret bör inte användas. Sporadiska miniatyr ändplattan potential bör nu vara synliga. Lämnar cellen för att stabilisera en minut innan du börjar spela in.
- Förändringar i membranpotential upptäcks med ett Axon HS-2A huvudet scenen och en Axoclamp 2B förstärkare och spelat in med Clampex v 8.2.0.235 (Axon Instruments). Den Axoclamp 2B är ansluten till en dator som kör pCLAMP programvara och fungerar tillsammans med Digidata 1322A gränssnittet.
- Celler registrerades under 3 minuter utan någon stimulans för att mäta mEJP svar. Spår analyserades med hjälp av Mini analysprogram (Synaptosoft, v 6.0.3) och mEJP amplitud och frekvens fastställas.
Nervstimulering:
- Den avskurna änden av motor neuron stimuleras med en rad kvadrat spänningspulser (0,3 ms varaktighet) vid en intensitet som är tillräcklig för både motor axoner, att framkalla konsekvent svar i hela muskeln.
- Den stimulans genereras med Master-8 pulsgenerator, som är programmerad för att leverera pulser kontinuerligt förhållande till hur länge och tider intervall.
- Låt fem sekunder mellan stimuli för synaptic återhämtning på NMJ.
- Vid bestämning av styrkan i den stimulans, börja med den lägsta nivån och öka intensiteten långsamt under flera rättegångar. Den minsta stimulusintensitet som resulterar i ett framkallat svar ska användas i experiment.
- När rätt stimulusintensitet uppnås bör det finnas en förening EJP och en muskelsammandragning framkallas av stimulans.
- Spela minst 10 evoked potentials från varje muskel och genomsnitt amplituder.
Del 3: representativa resultat
Figur 3. Representant intracellulära inspelning från muskel 6 visar väckte EJP s är svar på elektrisk stimulering av segmentell nerv, och den sporadiska miniatyr potentialer ändplattan eller mEJP talet. EJP amplituder i muskel 6 av friska vildtyp larver, såsom Canton S, är oftast runt 40 mV och mEJP amplituder mellan 1-3 mV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De metoder som beskrivs här ger en relativt snabb och bred sätt att upptäcka förändringar i synapserna vid NMJ. Förmågan att utföra elektrofysiologiska inspelningar med intakta djur in vivo och utföra genetiska eller farmakologiska manipulationer, gör Drosophila en idealisk djurmodell för att undersöka den fysiologiska och genetiska aspekter på neurotransmission.
Eftersom muskelcellerna är mycket stora, kan vissa föredrar att lägga till ytterligare ett steg i protokollet till två elektroder spänning klämma (TEVC) inspelning. Detta kan utföras på samma larvala beredningen av det intracellulära elektroden på plats, genom att placera ett ström-passerar elektrod på cellen. När cellen är tillräckligt spänning fastsatt, kan nuvarande svaret redovisas.
Även muskel 6 är den som används mest för elektrofysiologi inspelningar, kan musklerna 7 och 12 också användas.
De metoder som beskrivs här visar det viktigaste i Drosophophila NMJ elektrofysiologi - tekniker som först beskrevs av Jan och Jan i 1976, och har sedan stått modell för forskning synaptisk fysiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small Petri dishes (35 x 10 mm) | BD Biosciences | 1008 | |
| SYLGARD 182 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 3097366-1004 | |
| Dissecting microscope | Carl Zeiss, Inc. | 475002-9902 | |
| Light for microscope | Schott AG | KLI500 | |
| Dissection pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| pClamp 9 software | Molecular Devices | PCLAMP 9 STANDARD | |
| Dissection scissors: 3mm Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-0 | |
| Dumont SS Forceps | Fine Science Tools | 11200-33 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Thin-walled borosilicate glass capillaries, with filament (1.0 mm, 4 in) | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-4 | |
| Borosilicate glass capillaries, with filament (1.2 mm, 4 in) | World Precision Instruments, Inc. | 1B120F-4 | |
| Sutter P-2000 Laser Based Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | Model P-2000 | |
| Pipette polisher | Narishige International | MF-83 | |
| Axon HS-2A head stage | Molecular Devices | Model HS-2A | |
| Micromanipulators | Sutter Instrument Co. | MP-85 | |
| Axoclamp 2B amplifier | Molecular Devices | AXOCLAMP 2B | |
| Clampex Software | Molecular Devices | v 8.2.0.235 | |
| Mini analysis software. v 6.0.3 | Synaptosoft | ||
| Brownlee Precision Amplifier | Brownlee | Model 410 | |
| NaCl | Baker/VWR | 4058-01 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | p-9333 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | s6297-1kg | |
| Trelahose | Sigma-Aldrich | TO167 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | bp220-212 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | h-3375 | |
| MgCl-6H2O | Sigma-Aldrich | m2670-1kg | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | c79-500 | |
| Master-8 Pulse Generator | A.M.P.I | ||
| Vibration table for electrophysiology set up | Technical Manufacturing Corp. | ||
| Faraday Cage |
References
- Atwood, H. L., Govind, C. K., Wu, C. F. Differential ultrastructure of synaptic terminals on ventral longitudinal abdominal muscles in Drosophila larvae. J. Neurobiol. 24 (8), 1008-1024 (1993).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).
- Estes, P. S., Roos, J., van der Bliek, A., Kelly, R. B., Krishnan, K. S., Ramaswami, M. Traffic of dynamin within individual Drosophila synaptic boutons relative to compartment-specific markers. J Neurosci. 16, 5443-5456 (1996).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Protocol for dissection of Drosophila larvae. J Vis Exp. , (2008).
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster. J Physiol (Lond). 262, 189-214 (1976).
- Katz, L. C., Shatz, C. J. Synaptic activity and the construction of cortical circuits. Science. 274, 1133-1138 (1996).
