Metodi elettrofisiologici per la registrazione Potenziali Synaptic dal NMJ Larve di Drosophila

Summary

Qui si descrivono i metodi elettrofisiologici per la misurazione della trasmissione sinaptica a livello della giunzione neuromuscolare larva di Drosophila. Rilascio evocato è iniziata artificialmente stimolando gli assoni dei motoneuroni, e la trasmissione attraverso il NMJ può essere misurata la risposta postsinaptica evocata nel muscolo.

Abstract

In questo video, si descrivono i metodi elettrofisiologici per la registrazione, la trasmissione sinaptica a livello della giunzione neuromuscolare (NMJ) larva di Drosophila. Il sistema larvale neuromuscolare è una sinapsi modello per lo studio della fisiologia e la neurotrasmissione sinaptica, ed è un valido strumento di ricerca che ha definito la genetica ed è accessibile alla manipolazione sperimentale. Larve possono essere sezionato per mostrare il corpo muro muscolatura, sistema nervoso centrale, e dei nervi periferici. I muscoli di Drosophila e il loro modello di innervazione sono ben caratterizzati e muscoli sono di facile accesso per la registrazione intracellulare. Singoli muscoli possono essere identificati dalla loro posizione e l'orientamento all'interno degli 8 segmenti addominali, ciascuno con 30 muscoli disposti in uno schema che si ripete in segmenti A2 - A7. Sezionato larve drosofila sono i muscoli sottili e individuali e fasci di assoni dei neuroni motori possono essere visualizzati con transilluminazione

Protocol

Prima di iniziare la preparazione:

• Vagando yhird instar Drosophila larve
• HL3.1 (Modificata emolinfa-like) soluzione
• Sylgard (gomma siliconica trasparente) dissezione piatti preparati in piccolo (35 x 10 mm) scatole Petri in plastica usando i metodi descritti da Brent e McCabe (2008) ^3.
• Tagliare perni dissezione breve
• Stimolare pipette elettrodo
• Pipette di registrazione Sharp

HL3 Soluzione:

1. Durante dissezioni ed esperimenti elettrofisiologici, larva sono immersi in HL3.1 soluzione ² che contiene (in mm): 70 NaCl, 5 KCl, 4 MgCl _2, 10 NaHCO _3, 5 trealosio, 115 saccarosio, e 5 HEPES, pH 7,2.
2. Le concentrazioni di CaCl ₂ si aggiungono alla soluzione HL3.1 di fornire la necessaria concentrazione extracellulare di Ca ^{2 +.}
   • Dissezioni larvali vengono eseguiti a basse concentrazioni di Ca ^{2 +} (per evitare la contrazione muscolare) utilizzando HL3.1 + 0,25 mM CaCl _2, tenuta in ghiaccio.
   • Esperimenti elettrofisiologici sono in genere registrati in HL3.1 + 1 mM CaCl _2, ma questa può essere regolata 0,4-1 mM Ca ^{2 +} come richiesto.
3. La soluzione è HL3.1 filtro sterilizzati prima dell'uso, e conservati a 4 ˚ C.

Preparazione di stimolare e pipette di registrazione:

1. Pipette di registrazione e stimolanti sono tirati con un P-2000 Sutter estrattore basato Laser micropipetta utilizzando le seguenti impostazioni: calore = 390, Filament = 4, Velocità = 35, Delay = 200 e Pull = 0.
2. Elettrodi stimolanti sono preparati con pareti sottili capillari in vetro borosilicato con estremità ampia che erano leggermente più grande della larghezza della assoni motori reciso. Le estremità sono a forma di firepolished per dare una finitura liscia (utilizzando una pipetta Narashiga lucidatore), per minimizzare i danni al nervo. Elettrodi stimolanti sono riempite con soluzione bagno (HL3.1 + 1 mM Ca ^{2 +).}
3. Gli elettrodi di registrazione sono preparati da 1,2 millimetri di vetro borosilicato, che viene prelevata per formare una pipetta acuto (30-60 mΩ), e riempito di KCl 3M.

Parte 1: dissezione di larve di Drosophila

1. Terzo larve instar erranti sono sezionato per mostrare i muscoli nella parete del corpo come descritto in precedenza ^4.
2. Dissezioni sono eseguite in HL3.1 + 0,25 mM Ca ^{2 +} su lastre di silicone piccolo (35 x 10 mm). HL3.1 soluzione deve essere ghiacciata per dissezioni al fine di anestetizzare la larva, e viene mantenuto in ghiaccio prima e durante la dissezione.
3. Le larve sono sezionati utilizzando i metodi descritti da Brent e McCabe (2008), che viene modificato per gli esperimenti di elettrofisiologia con l'aggiunta di 0,25 mm Ca ^{2 +} alla soluzione HL3.1 dissezione, e con perni dissezione breve (circa 2 mm di lunghezza) che sono meno probabilità di colpire l'obiettivo microscopio e gli elettrodi durante un esperimento.
4. A seguito di dissezione, gli assoni motori delle larve sono interrotti. Questo viene fatto delicatamente tenendo il sistema nervoso centrale e alzando leggermente in modo da i nervi periferici che innervano i muscoli posteriori del ganglio ventrale può essere tagliata senza danneggiare i muscoli (Figura 1). Il cervello viene quindi rimosso.
5. La preparazione larvale sezionato viene lavato due volte con HL3.1 + 1 mM Ca ^{2 +.}

Figura 1. Schematica che mostra i passaggi necessari per il taglio del assoni motori di larve sezionato. La CNS è sollevato con una pinza e gli assoni motori sono tagliati alla base del cervello.

Parte 2: le registrazioni intracellulari da cellule muscolari larvale.

1. Posizionare la piastra di dissezione sul microscopio elettrofisiologia e sommergere la preparazione con HL3.1 + 1,5 mM Ca ^{2 +} e fissare l'elettrodo in modo da bagno è in contatto con la soluzione.
2. Tutti gli esperimenti vengono eseguiti su muscoli 6 anni entro il terzo segmento addominale (A3). Nervi periferici che innervano i muscoli sono stimolati utilizzando un elettrodo di aspirazione ^5.
3. Posizionare l'elettrodo stimolante il primo piatto per evitare vibrazioni quando l'elettrodo intracellulare è a posto. Posizionare l'elettrodo stimolante in prossimità del neurone motore innervano muscoli 6 e applicare delicata aspirazione fino a quando il nervo taglio è all'interno della pipetta di vetro. Fare attenzione a non allungare i nervi quando l'aspirazione viene applicata. Sollevare la pipetta leggermente in modo che non tocchi il muscolo e posizionarla in modo che non è tirando le fibre nervose taglio (Figura 2).
   
   Figura 2. Uno schema della muscolatura e motoneuroni innervano di un segmento addominale dalla larva di Drosophila. La posizione della pipetta stimolante e reciso i nervi e l'elettrodo di registrazione in posizione muscolare 6 sono illustrati.
4. Intraregistrazioni cellulari sono realizzate con i microelettrodi affilato pieno di 3 M KCl. Posizionare l'elettrodo di registrazione sopra il centro del muscolo 6 sul terzo segmento addominale (A3) e regolare l'ingresso di offset in modo che legga zero per la soluzione del bagno. Abbassare lentamente l'elettrodo e l'approccio al muscolo sotto alto ingrandimento ottico fino a toccare la superficie del muscolo. Guarda l'oscilloscopio per confermare che il muscolo è stato penetrato. Il potenziale di membrana a riposo deve essere di almeno -60 mV, o l'animale non deve essere utilizzato. Sporadici potenzialità placca in miniatura dovrebbe essere visibile. Lasciare la cella di stabilizzare per un minuto prima di iniziare a registrare.
5. Variazioni del potenziale di membrana vengono rilevati con un HS-2A stadio testa Axon e un amplificatore 2B Axoclamp e registrato con CLAMPEX v 8.2.0.235 (Axon Instruments). La 2B Axoclamp è interfacciato con un computer che esegue software pCLAMP e lavora in congiunzione con l'interfaccia Digidata 1322A.
6. Le cellule sono state registrate per 3 minuti senza nessuno stimolo a misurare le risposte mEJP. Le tracce sono state analizzate utilizzando un software di analisi Mini (Synaptosoft, v 6.0.3) e l'ampiezza e la frequenza mEJP determinato.

La stimolazione del nervo:

1. La fine reciso del neurone motore viene stimolato con una serie di impulsi di tensione quadrati (0,3 ms di durata) con un'intensità che è sufficiente per entrambe le assoni motori, per evocare risposte coerenti in tutto il muscolo.
2. Lo stimolo viene generato con il Maestro-8 generatore di impulsi, che è programmato per fornire impulsi continuamente a seconda della durata e tempi di intervallo.
3. Lasciate cinque secondi tra gli stimoli per il recupero sinaptico al NMJ.
4. Nel determinare l'intensità dello stimolo, iniziare con il più basso livello e aumentare l'intensità lentamente diverse prove. L'intensità dello stimolo minimo che si traduce in una risposta evocata deve essere utilizzato negli esperimenti.
5. Quando l'intensità dello stimolo appropriato è raggiunto, ci dovrebbe essere una EJP composto e una contrazione muscolare evocata dallo stimolo.
6. Record di almeno 10 potenziali evocati da ogni muscolo e media le ampiezze.

Parte 3: Risultati Rappresentante

Figura 3. Rappresentante registrazione intracellulare dal muscolo 6 mostra la evocato EJP è risposta alla stimolazione elettrica del nervo segmentale, e le potenzialità sporadici placca in miniatura, o di mEJP. Ampiezze EJP nel muscolo 6 di sano wild-type larve, come il Canton S, sono in genere circa 40 mV e le ampiezze mEJP tra 1-3 mV.

Discussion

I metodi descritti qui forniscono un modo relativamente rapido e ampio per rilevare i cambiamenti nella funzione sinaptica alla NMJ. La possibilità di effettuare registrazioni elettrofisiologiche su animali intatti in vivo, ed eseguire manipolazioni genetiche o farmacologiche, fanno Drosophila un modello animale ideale per indagare gli aspetti fisiologici e genetici della neurotrasmissione.

Dato che le cellule muscolari sono molto grandi, qualcuno potrebbe preferire di aggiungere un ulteriore passaggio di questo protocollo per due elettrodi di tensione morsetto (TEVC) di registrazione. Questo può essere effettuata sulla preparazione stessa larvale con l'elettrodo in posizione intracellulare, posizionando una corrente che passa elettrodi della cella. Una volta che la cella è sufficiente tensione bloccato, la risposta corrente può essere registrato.

Sebbene muscolare 6 è il più comunemente usato per le registrazioni elettrofisiologiche, i muscoli 7 e 12 può essere utilizzato anche.

I metodi descritti qui mostrare gli elementi essenziali della Drosophophila NMJ elettrofisiologia - tecniche che sono stati descritti da Jan e Jan nel 1976, e da allora diventato il modello di sistema per la ricerca di fisiologia sinaptica.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Small Petri dishes (35 x 10 mm)	BD Biosciences	1008
SYLGARD 182 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	3097366-1004
Dissecting microscope	Carl Zeiss, Inc.	475002-9902
Light for microscope	Schott AG	KLI500
Dissection pins	Fine Science Tools	26002-10
pClamp 9 software	Molecular Devices	PCLAMP 9 STANDARD
Dissection scissors: 3mm Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-0
Dumont SS Forceps	Fine Science Tools	11200-33
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-20
Thin-walled borosilicate glass capillaries, with filament (1.0 mm, 4 in)	World Precision Instruments, Inc.	TW100F-4
Borosilicate glass capillaries, with filament (1.2 mm, 4 in)	World Precision Instruments, Inc.	1B120F-4
Sutter P-2000 Laser Based Micropipette Puller	Sutter Instrument Co.	Model P-2000
Pipette polisher	Narishige International	MF-83
Axon HS-2A head stage	Molecular Devices	Model HS-2A
Micromanipulators	Sutter Instrument Co.	MP-85
Axoclamp 2B amplifier	Molecular Devices	AXOCLAMP 2B
Clampex Software	Molecular Devices	v 8.2.0.235
Mini analysis software. v 6.0.3	Synaptosoft
Brownlee Precision Amplifier	Brownlee	Model 410
NaCl	Baker/VWR	4058-01
KCl	Sigma-Aldrich	p-9333
NaHCO3	Sigma-Aldrich	s6297-1kg
Trelahose	Sigma-Aldrich	TO167
Sucrose	Fisher Scientific	bp220-212
HEPES	Sigma-Aldrich	h-3375
MgCl-6H2O	Sigma-Aldrich	m2670-1kg
CaCl2	Fisher Scientific	c79-500
Master-8 Pulse Generator	A.M.P.I
Vibration table for electrophysiology set up	Technical Manufacturing Corp.
Faraday Cage