Summary
В этой статье описываются высоким временным и пространственным разрешением технику оптически образ потенциала действия движения на поверхности Langendorff-перфузии сердца крысы использованием потенциометрического красителя (ди-8-ANEPPS).
Protocol
Часть 1: Подготовка решений и изолированной перфузии система сердца
- В первой половине дня эксперимента, 4,0 л Кребса Хенселейта готовят, как описано ранее [5, 6].
- 11 ммоль / л 2,3-бутандион monoxime (BDM) растворяют в 1,0 л Кребса Хенселейта сливают из перфузат подготовлен в шаге 1.1.
- Дополнительные 150 мл Кребса Henseleit удаляется из перфузат подготовлен в шаге 1.1 и смешивают с 5 моль / л ди-8-ANEPPS (разбавленный от 10 ммоль / л растворенного в акции диметилсульфоксид (ДМСО)).
- Эти три решения передаются на водяной рубашкой стекла водохранилищ (Radnoti), где они предварительно нагревают до 41,0 ° С и кислородом с погруженной барботер (Radnoti) с использованием 0,2 мкм фильтром 95% O 2, 5% СО 2. Решения от 3 резервуара запаса перекачивается настенные системы Langendorff с Masterflex ™ L / S перистальтических насосов и низким поглощением силиконовые трубки (Cole-Parmer).
- Перед сборкой, Langendorff системы стеклянная посуда (Radnoti) тщательно промывают E-TOXA-CLEAN реагента (Sigma-Aldrich) и тщательно промыть 0,1 М / л HCl, 100% этанола и дистиллированной воды.
- Без рециркуляции Langendorff аппарат был построен по доставке 70 мм рт постоянного давления от 3 отдельных кислородом водоемах, которые отделены от сердца с водяной рубашкой нагрева катушки и пузырь ловушек (Radnoti) [7]. 3 независимых линий перфузии сходятся выше сердца на двух 3-полосная кранами, что позволяет нам точно контролировать доставку растворов, приготовленных с шагом 1,1 до 1,3. С водяной рубашкой посуды подключается последовательно с Masterflex Pharmed трубки BPT (Cole-Parmer) и нагревают до 39 ° С дистиллированной воды с помощью двух E100 циркуляторы (Лауда). Потери тепла через платиновые сушки силиконовые трубки (Cole-Parmer), который подключается к давлению головы резервуары для нагрева катушки и пузырь ловушки привели к 37 ° C перфузат достижения сердце.
Часть 2: Harvest сердца крысы и настройки перфузии Langendorff
- Для стимулирования глубокой общей анестезии в 200-250 г Льюис крыс 100 мг / кг кетамина и 10 мг / кг Ксилазин вводят внутрибрюшинно полости. К этой смеси добавить 500 ЕД / кг гепарина для предотвращения свертывания крови и ишемии миокарда во время эксплантации процедуры.
- Для легкого доступа к сердца и магистральных сосудов, передней стенки грудной клетки удаляется. После этого, окружающие ткани, тщательно расчленены и перикарда мешок открыт.
- После идентификации нижнюю полую вену, этот сосуд лигируют с 5-0 шелк (Ethicon) и все сердце-легкие блок эксплантированных. Ткань сразу помещают в ледяной Кребса Хенселейта, содержащихся в 50 мл стакан на льду.
- Восходящей аорты быстро выявлены и расчлененных от окружающих тканей. Соответствующего размера канюли (Harvard аппарата) вводится в аорту, заботясь, чтобы не прерывать обязательным перфузии коронарных артериях путем введения канюли слишком далеко в корне аорты. Канюля прикреплена к восходящей аорты с 5-0 шелк (Ethicon).
- Сердце крысы затем помещается в аппарат Langendorff без введения пузырьков воздуха в канюлю. Ретроградная перфузия коронарных сосудов в настоящее время установлено с теплой, насыщенной кислородом Кребса Хенселейта от давления головы, описанных в пункте 1.6.
- Дополнительные ткани, включая легкие, теперь удалены и сердце перфузии в течение 20 минут разрешить восстановление функции и стабилизировать ритм. В это время, очень тонкий термопарой температуру (Коул-Пармер) вводится в полость левого желудочка и зашивается в месте с 5-0 Prolene шва (Ethicon). Зонд соединен с термо-контроллер (Digi-Sense), чтобы обеспечить температуру сердца поддерживается на уровне 37 ° С, регулируя настройки водяных насосов кровообращения. Движение от перфузат капает с сердечной вершине сведена к минимуму путем размещения кусок марли в сточных водах сосуд.
Часть 3: Загрузка сердце потенциометрического красителя и приобрести электрографии и оптических сигналов
- Ди-8-ANEPPS (Invitrogen) загружается в сердце за счет перехода на перфузию строку, содержащую Кребса Henseleit смешанного с использованием флуоресцентного красителя краном. Кроме того, канюли 18G помещается в левый и / или правого предсердия и дополнительные 50 мл раствора красителя медленно вводят в каждой из этих камер, потому что они не являются достаточно озарен краситель вводится через коронарные артерии.
- Во время процедуры загрузки, 3 отведений ЭКГ (Harvard аппарата) мягко размещены на поверхности сердца, что не грозит оптика используется для отображения. Электрод N O 1 расположен на задней апикальной части левого желудочка, N 2 O на левое предсердие, а N
- ЭКГ усилитель (Hugo Sachs Elektronik) настройки: Фильтр высоких частот: 0,1 Гц
Фильтр низких частот: 150 Гц - CMOS-камера (RedShirt Imaging) и macroscope позиционируется использованием XYZ корректировки так, чтобы поверхность сердца находится в фокусе и по центру в приобретении кадра. Камеры и оптики смонтированы на стол виброизоляции (минус К Technology) для минимизации резонансных частотах. В то же время, коаксиальных электродов стимуляции (Harvard аппарата), контролируемых с изолированной, S48 электрической стимуляции единицы (трава), находится на правом предсердии и сердце темп в 300 ударов в минуту (рис. 1).
- Электростимуляция (трава) параметры:
Оценить: 5 импульсов в секунду
Задержка: 0,2 мс
Продолжительность: 2 мс
Вольт: 6-12 V
Режим: Повторите
Пульс: Одноместный - Для оптической записи которых отсутствуют артефакты от сжатия, сердце должно быть электромеханическим отцепили. Мы делаем это снова переключения перфузии линии Кребса Хенселейта, который содержит 11 ммоль / л BDM. Между поглощений, сердце озарен чистейший Кребса Henseleit, чтобы помочь сохранить жизнеспособность подготовки.
- Запись параметры задаются с помощью программного обеспечения (RedShirt Imaging) со следующими параметрами приобретения:
Конфигурация: 2000 Гц; 128x128 пикселей массив
Frame Interval: 0,5 мс
Камера усиления усилителя: 5x
On-Chip Усиление: 8x-12Me-а
Затвор: 500 мс задержки
Количество кадров: 4000
Продолжительность: 2000 мс - Все комнаты и оборудование свет выключен или экранированный для устранения фоновых шумов во время записи. Светодиод горит сердце только во время оптической записи, чтобы уменьшить фото-отбеливание и красителя токсичности. Свет затвора источник управляется с 5 V импульса доставлен через панель управления в виде D-до-плату в компьютер (RedShirt Imaging).
Часть 4: Анализ приобретения информации с использованием программного обеспечения RedShirt изображений
- После приобретения, данные обрабатываются с использованием различных параметров фильтра. Мы обычно используем настройки по умолчанию, за исключением при регулировке Группа Стоп / Pass фильтр, который устанавливается с левой границы на 44,0 и правой границы на 98,0. Потом записали информация обрабатывается и кино порождается (RedShirt Imaging).
- Данные из одной приобретение соответствует местной электрической активации на 16 384 сайтах в сердце поверхности в течение 2 секунд. Программное обеспечение позволяет эти локальные сигналы, которые будут непосредственно сравнивать друг с другом и с предсердий и желудочков электрографических записей. Затем данные визуализируются путем сопоставления местной электрической активации по цвету и оказание эту информацию, как анимация показывает пространственно-временной электрической активации на сердечную поверхности. Для создания такой анимации, мы используем программное обеспечение:
- во времени и / или пространственно фильтрации данных
- выберите время начала и окончания для анимации
- Карта оптических сигналов на цвет, основываясь на покоящихся интенсивность света каждого пикселя
- Наложение полученные данные цвета с изображением сердца
- генерировать анимацию
Часть 5: Представитель результаты
Если перфузии подготовке сердце было неподвижно во время записи, оптические сигналы показывают один четкий пик для каждого пикселя, участвующих в изменении интенсивности излучения ди-8-ANEPPS. Соответствующие фильмы (рис. 3 и 4) продемонстрировать перед возбуждения волны, распространяющейся по всей поверхности эпикарда сердца, а также одновременно приобрел электрографических записи (рис. 2).
Рисунок 1. Фотографию Langendorff-перфузии сердца подготовки изображением позиций ходить электрода на правое предсердие и отведений ЭКГ, как описано в пункте 3.2.
Рисунок 2. Представителю оптических сигналов и электрографии записи с перфузии сердца крысы Льюис. Группа показывает изображение поверхности эпикарда используемых для оптических изображений. Положение пикселей выбран для демонстрации изменения в флуоресценцию излучения с течением времени в панели B обозначены цветными стрелами. Электрографические сигналы отображаются в панели C с красной линией, указывающей предсердной активации и голубые линии, соответствующей желудочка сигнала. Пожалуйстаve.com/files/ftp_upload/1138/Figure4.jpg "> нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Удаление сердца от анестезии крыс должна быть выполнена быстро, чтобы избежать ишемии миокарда. Если ишемия или недостаточное коронарной перфузии происходит, сердце, скорее всего, развиваться аритмий и может стать инфаркта. Кроме того, эти сердца покажет недостаточной флуоресценции выбросов информативные записи и последующего анализа. Перед загрузкой краситель, клетки миокарда должны быть надлежащим образом озарен Кребса Хенселейта для установления и поддержания физиологической среде электролита для стабильности электрических импульсов. Точная подготовка перфузат также необходимо для поддержания нормальной жизнеспособности органов и функций. Различия в концентрации электролита или недостаточная фильтрация перфузат, вероятно, приведет к фатальным дисфункции миокарда и нарушениями ритма сердца. Для оптической записи, сердце должно быть полностью загружен с напряжением чувствительных красителя. Это особенно важно для предсердного миокарда, как эти камеры не очень хорошо перфузии на коронарных артериях. Мы обнаружили, что дополнительные внутри-полостной перфузии предсердий создаст хороший оптический сигнал. Кроме того, приобретение высококачественных обводка напряжения требует перфузии сердца, чтобы быть неподвижна, в противном случае, изменения флуоресценции выбросов не может быть надежно использованы для отслеживания изменений мембранного потенциала с высокой точностью из-за артефактов, вызванных сигнала дрейфа. В результате будет несколько пиков на один пиксель, а не один пик. Другие методы для устранения артефактов движения из оптических записи включают механические иммобилизации, лечение другими возбуждение-сокращение разобщители (например цитохалазином D, blebbistatin), обработки сигналов, а также математического моделирования [1, 8]. Наконец, метод, описанный здесь только предоставляет информацию о движении потенциала действия на сердечную эпикардиальных поверхности. Альтернативные тканевые препараты и инфракрасного потенциометрического красителей может решить электрические характеристики распространения в других регионах сердце.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Эксперименты на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами и правилами, установленными Институциональные уходу и использованию животных комитетом на Детской больнице Бостона.
Acknowledgments
Эта работа проводится при поддержке грантов от Национального института здоровья (HL068915; HL088206) и взносов в Фонд сердечной проводимости при Детской больнице Бостона.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| CardioCMOS-SM128f | Equipment | RedShirtImaging, LLC | ||
| CardioPlex Software | Equipment | RedShirtImaging, LLC | ||
| LUXEON LED Light Source 460-490 nm | Equipment | Lumileds Lighting, US, LLC, San Jose, CA 95131 USA | LXHL-PB02 | |
| ECG Amplifier Type 689 Hugo Sachs Elektronik | Equipment | Harvard Apparatus | 730149 | |
| Dichroic Mirror 505 nm | Equipment | Semrock | FF505-SDi01-25x36 | |
| Emission Filter 605 nm Long Pass | Equipment | SciMedia | ||
| THT Sideways | Equipment | SciMedia | 25 BM-8 | |
| Mini Ball Joint Holder | Equipment | Harvard Apparatus | BS4 73-0177 | |
| Small Stimulation Electrode Set | Equipment | Harvard Apparatus | BS4 73-0160 | |
| BM-6 Benchtop Vibration Isolation Platform | Equipment | Technology Inc., Inglewood, CA 90301 | 25 BM-6 | |
| Monopolar ECG Electrode | Equipment | Harvard Apparatus | BS4 73-0200 | |
| Roller Pump SCI 400 | Equipment | Watson-Marlow Pumps Group | 401U/D1 | |
| Roller Pump MasterFlex Easy Load II | Equipment | Cole-Parmer | Model 77201-60 | |
| Tubing Marprene #14 | Equipment | Watson-Marlow Pumps Group | 902.0016.016 | |
| MasterFlex Tubing | Equipment | PharMed, Westlake, OH 44145 USA | 06485-25 | |
| S48 Square Pulse Stimulator | Equipment | Grass Technologies | Model S48 | |
| SIU5 RF TRANSFORMER ISOLATION UNIT | Equipment | Grass Technologies | Model SIU5 | |
| 5 Liter Water Jacketed Reservoir | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 120142-5 | |
| 2 Liter Water Jacketed Reservoir | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 120142-2 | |
| 0.5 Liter Water Jacketed Reservoir | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 120142-0 | |
| 0.25 Liter Water Jacketed Reservoir | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 120142-025 | |
| 10 ml Heating Coil | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 158822 | |
| Compliance Bubble Trap | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 130149 | |
| Luer Disconnect Cannula | Equipment | Harvard Apparatus | 72-1444 | |
| 3-Way stopcock, FLL to MLT, No Port Covers | Equipment | Harvard Apparatus | BS4 72-2630 | |
| Thermocouple Thermometer | Equipment | Cole-Parmer | WU-91100-40 | |
| Ultra Fine IT-Series Flexible Microprobe | Equipment | PhysiTemp Instruments Inc., Clifton, NJ 07013 USA | IT-24P | |
| Oscilloscope Tektronix TDS 1002 | Equipment | Tektronix, Inc. | TDS 1002B | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Reagent | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| Ketamine HCl | Reagent | Hospira Inc. | RL-0065 | |
| Xylazine | Reagent | Lloyd, Inc. | LB15705A | |
| E-TOXA-CLEAN® | Reagent | Sigma-Aldrich | E9029 | |
| Di-8-ANEPPS | Reagent | Invitrogen | D-3167 |
References
- Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G.
- Hucker, W. J. Images in cardiovascular medicine. Optical mapping of the human atrioventricular junction. Circulation. 117 (11), 1474-147 (2008).
- Entcheva, E., Bien, H. Macroscopic optical mapping of excitation in cardiac cell networks with ultra-high spatiotemporal resolution. Prog Biophys Mol Biol. 92 (2), 232-257 (2006).
- Entcheva, E. Fluorescence imaging of electrical activity in cardiac cells using an all-solid-state system. IEEE Trans Biomed Eng. 51 (2), 333-341 (2004).
- Stamm, C. Rapid endotoxin-induced alterations in myocardial calcium handling: obligatory role of cardiac TNF-alpha. Anesthesiology. 95 (6), 1396-1405 (2001).
- Choi, Y. H. Cardiac conduction through engineered tissue. Am J Pathol. 169 (1), 72-85 (2006).
- Skrzypiec-Spring, M. Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium. J Pharmacol Toxicol Methods. 55 (2), 113-126 (2007).
- Fedorov, V. V. Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts. Heart Rhythm. 4 (5), 619-626 (2007).
