Summary
Bu makale, potansiyometrik boya kullanarak (di-8-ANEPPS) Langendorff perfüze sıçan kalpleri yüzeyinde optik görüntü aksiyon potansiyeli hareketi yüksek bir zamansal ve mekansal çözünürlükte tekniği açıklar.
Abstract
Voltaj duyarlı floresan boya ile kalp yüzey Optik haritalama deneysel modellerde elektrik uyarım araştırmak için önemli bir araç haline geldiğini hücre kültürleri bütün organları ölçek aralığı
Protocol
Bölüm 1: hazırlayın çözümleri ve izole perfüze kalp sistemi
- [5, 6] açıklandığı gibi deney sabahı, Krebs-Henseleit çözüm 4.0 L hazırlanmıştır.
- 11 mmol / L 2,3-butanedione monoxime (DGM) 1.0 L adım 1.1 'de hazırlanan perfüzat dekante Krebs-Henseleit çözüm çözülür.
- Krebs-Henseleit ek bir 150 ml, adım 1.1 'de hazırlanan perfüzat kaldırılır ve 5 Mol / L di-8-ANEPPS (dimetil sülfoksit (DMSO) içinde çözünmüş 10 mmol / L stok seyreltilmiş) ile karıştırılır.
- % 5 CO 2 gaz Bu 3 çözümler su-ceketli cam rezervuarlar (Radnoti) 41,0 ° C önceden ısınmış ve% 95 O 2 mikron filtreden 0.2 kullanarak bir batık bubbler (Radnoti) ile oksijenli aktarılır. 3 stok rezervuarları Çözümleri MASTERFLEX ™ L / S peristaltik pompalar ve düşük emme silikon tüp (Cole-Parmer) ile duvara monte Langendorff sistemine pompalanır.
- Montaj öncesinde Langendorff sistem cam (Radnoti) titizlikle E-TOXA TEMİZ reaktif (Sigma-Aldrich) ile yıkanmış ve 0.1 M / L HCl,% 100 etanol ve saf su ile iyice durulanmalıdır.
- Sirkülasyon olmayan Langendorff aparat, 3 ayrı su ceketli ısıtma bobinleri ve kabarcık tuzakları ile kalp ayrılır oksijenli depoları, 70 mmHg sabit basınç sağlamak için inşa edilmiştir (Radnoti) [7] . 3 bağımsız perfüzyon hatları 1.1 - 1.3 için adımları hazırlanan çözümler teslim bize tam kontrol etmeye izin veren, 3-yollu iki stopcocks kalp üzerinde birleşir. Su ceketli cam MASTERFLEX PharMed BPT boru (Cole-Parmer) ile seri olarak bağlı ve 39 ısındı ° C distile su kullanarak iki E100 sirkülatörler (Lauda). Isıtma bobinleri ve kabarcık tuzakları basınç baş rezervuarları bağlayan platin kurutulmuş silikon tüp (Cole-Parmer) yoluyla ısı kaybı, 37 ° C perfüzat kalp ulaşan sonuçlandı.
Bölüm 2: Hasat sıçan kalp ve set-up Langendorff perfüzyon
- 200-250 g Lewis sıçanlarda derin genel anestezi uygulamak için, 100 mg / kg Ketamin ve 10 mg / kg Xylazine intraperitoneal boşluğuna enjekte edilir. Bu karışımı, biz eksplantasyonu işlemi sırasında kan pıhtılaşması ve miyokard iskemisi önlemek için 500 U / kg Heparin ekleyin.
- Kalp ve büyük damarların kolay erişim için, göğüs ön duvarı kaldırılır. Bundan sonra, çevredeki doku dikkatlice disseke ve perikardiyal çuval açıldı.
- Inferior vena kava belirlenmesini takiben, bu gemi, 5-0 ipek (Ethicon) ve tüm kalp-akciğer bloğu eksplante ile bağlandı. Doku hemen buz 50 ml beher bulunan buz Krebs-Henseleit çözüm yerleştirilir.
- Asendan aorta hızla tespit ve çevresindeki doku disseke edilir. Uygun ölçekli bir kanül (Harvard Apparatus), çok ileri aort kökü içine kanül takarak, koroner arter zorunlu perfüzyon kesilmesini önlemek için özen, aort içine yerleştirilir. Kanül 5-0 ipek (Ethicon) ile çıkan aortun güvence altına alınmıştır.
- Sıçan kalp sonra kanül içine hava kabarcıklarının tanıtan Langendorff aparat yerleştirilir. Retrograd koroner arter perfüzyon şimdi adım 1.6 'da açıklanan basınç kafa sıcak, oksijenli Krebs-Henseleit çözümü ile kurulmuştur.
- Ekstra doku, akciğerler dahil olmak üzere şimdi kaldırılır ve kalp fonksiyonu kurtarma izni ve ritmini istikrara kavuşturmak için 20 dakika boyunca perfüze. Bu süre zarfında, çok ince bir termokupl sıcaklık probu (Cole-Parmer) sol ventrikül boşluğuna tanıtıldı ve 5-0 Prolen sütür (Ethicon) ile de sütüre. Prob kalbin sıcaklığını sağlamak için bir termo-denetleyici (Digi-Sense) bağlı 37 muhafaza ° C su dolaşım pompalarının ayarlarını. Kalp ucundan damlayan perfüzat Hareket atık priz bir gazlı bez parçası koyarak en aza indirilmiştir.
Bölüm 3: potansiyometrik boya ile Yük kalp ve elektrografik ve optik sinyalleri elde
- Di-8-ANEPPS (Invitrogen) içeren Krebs-Henseleit karışık bir stopcock kullanarak floresan boya ile perfüzyon hattına geçiş yaparak kalp yüklenir. Buna ek olarak, 18G kanül yeterince koroner arterler yoluyla getirilen boya ile perfüze değildir çünkü yavaş yavaş bu odaların her birine uygulanan boya çözüm sol ve / veya sağ atrium ve ek 50 ml yerleştirilir.
- Yükleme işlemi sırasında, 3 EKG yol açar (Harvard Apparatus) haritalama için kullanılan optik karşı karşıya değiliz kalbin yüzeyine hafifçe yerleştirilir. Elektrot N o 1, arka sol ventrikül apikal kısmının, K sol atrium o 2 ve N tarafta konumlandırılmış
- EKG amplifikatör (Hugo Sachs Elektronik) ayarları: High Pass Filtre: 0.1 Hz
Alçak Geçiren Filtre: 150 Hz - CMOS kamera (RedShirt Görüntüleme) ve Makroskop'ta kalbin yüzeyine odak ve satın çerçeve merkezli böylece XYZ ayarlamalarını kullanarak konumlandırılmış. Rezonans frekansları en aza indirmek için bir titreşim izolasyonu tablosu (Eksi K Teknolojisi) kamera ve optik üzerine monte edilir. Aynı zamanda, bir koaksiyel pacing elektrod (Harvard Apparatus), izole, S48 elektrik stimülasyon birimi (Çim) ile kontrol sağ atriyuma yerleştirilen ve kalp dakikada 300 vuruş (Şekil 1) tempolu.
- Elektrik stimülasyon (Çim) ayarları:
Hızı: saniyede 5 bakliyat
Gecikme: 0,2 ms
Süresi: 2 ms
Volt: 6-12 V
Modu: Tekrarla
Nabız: Tek - Daralma hareket eserler eksikliği optik kayıtları, kalp elektromekanik Kuplajsız gerekir. Biz yine 11 mmol / L BDM içeren Krebs-Henseleit çözüm perfüzyon hatları geçiş yaparak bunu. Satın almalar arasında, kalp hazırlık canlılığı korumaya yardımcı olmak için katkısız Krebs-Henseleit ile perfüze.
- Aşağıdaki satın alma ayarları ile yazılım (RedShirt Imaging) kullanarak kayıt parametreleri ayarlanır:
Yapılandırma: 2.000 Hz, 128x128 piksel
Kare Aralığı: 0.5 ms
Kamera Amplifikatör Kazanç: 5x
On-Chip Kazanç: 8x-12Me-kuyu
Perde Hızı: 500 ms gecikme
Çerçeveler sayısı: 4000
Süre: 2000 ms - Tüm oda ve ekipman ışıkları kapalı ya da kayıt sırasında arka plan gürültüsünü ortadan kaldırmak için korumalı. LED ışık fotoğraf ağartma ve boya toksisite azaltmak için optik kayıt sırasında sadece kalp yanar. Işık kaynağı, perde, kontrol paneli üzerinden bilgisayara D-A kurulu (RedShirt Görüntüleme) yolu ile teslim bir 5 V darbesi ile kontrol edilir.
Bölüm 4: RedShirt Görüntüleme Yazılımı kullanarak satın alma bilgileri analiz
- Satın alınmasının ardından, veri, farklı filtre ayarları kullanarak işlenir. Biz genellikle Band / Durdur, 44.0 sol sınır ve sağ sınır 98,0 az filtre, pas ayarlarken dışında varsayılan ayarları kullanabilirsiniz. Daha sonra kaydedilen bilgiler işlenir ve bir film (RedShirt Görüntüleme) oluşturulur.
- Bir satın alma elde edilen veriler, 2 saniyelik bir süre içinde kalp yüzeyinde 16.384 siteleri yerel elektrik aktivasyonu için karşılık gelir. Yazılım, bu yerel sinyaller doğrudan birbirleri ile ve atriyal ve ventriküler elektrografik kayıtları ile karşılaştırılmasına olanak tanır. Veri sonra renk yerel elektrik aktivasyon haritalama ve kalp yüzeyinde uzaysal elektrik aktivasyonu gösteren bir animasyon olarak bu bilgileri işleme ile görünür. Böyle bir animasyon oluşturmak için, biz için yazılım kullanabilirsiniz:
- zamansal ve / veya mekansal verilere filtre
- animasyon için bir başlangıç ve bitiş zamanı seçin
- her pikselin dinlenme ışık yoğunluğuna göre renk haritası optik sinyalleri
- kalp resmi ile ortaya çıkan renk veri bindirme
- animasyon oluşturmak
Bölüm 5: Temsilci sonuçları
Perfüze kalp hazırlanması kayıt sırasında hareketsiz ise, optik sinyalleri di-8-ANEPPS emisyon yoğunluğu değişikliği dahil her piksel için ayrı zirve göstermektedir. Ilgili filmleri (Şekil 3 ve 4), kalp gibi aynı anda alınan elektrografik kayıtları (Şekil 2) epikardiyal yüzeyi boyunca yayılan bir eksitasyon dalga ön göstermektedir.
Şekil 1. Langendorff-perfüze kalp hazırlık bir fotoğraf, sağ atrium pacing elektrot pozisyonları resmeden ve EKG adım 3.2 'de açıklandığı gibi açar .
Şekil 2, perfüze Lewis sıçan kalbinde Temsilcisi optik sinyalleri ve elektrografik kayıtları . Panel A epikardiyal yüzeyi optik görüntüleme için kullanılan bir görüntü gösterir. B Paneli zamanla floresans emisyon değişiklik göstermek üzere seçilen piksel konumunu renkli oklarla gösterilir. Panel C Elektrografik sinyalleri belirten atriyal aktivasyon ve ventriküler sinyale karşılık gelen açık mavi çizgi kırmızı çizgi ile gösterilmiştir. Lütfenve.com/files/ftp_upload/1138/Figure4.jpg ">, bu rakamın büyük bir halini görmek için buraya tıklayın .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Miyokard iskemisi önlemek için anestezi uygulanmış sıçanlarda kalp kaldırılması hızla yapılmalıdır. Iskemi veya yetersiz koroner perfüzyon oluşursa, kalp büyük olasılıkla aritmiler geliştirmek ve enfarkte olabilir. Ayrıca, bu kalpleri bilgilendirici kayıtları ve daha sonraki analizler için yeterli floresan emisyon gösterecektir. Boya yüklemeden önce, miyokard hücrelerinin elektriksel impulsları istikrar için bir fizyolojik elektrolit ortam kurmak ve sürdürmek için yeterli Krebs-Henseleit solüsyonu ile perfüze gerekir. Perfüzat doğru hazırlanması, aynı zamanda uygun organ canlılığı ve fonksiyonu sürdürmek için gerekli. Elektrolit konsantrasyonu veya perfüzat yetersiz filtreleme farklılıklar muhtemelen ölümcül miyokard fonksiyon bozukluğu ve kalp ritmi bozuklukları yol açacaktır. Optik kayıtlar için, kalp tamamen voltaj duyarlı boya ile yüklü olmalıdır. Bu odaları koroner arterlerin perfüze değil olduğu gibi bu atriyal miyokardda için özellikle önemlidir. Biz kulakçıklar ek intra-kaviter perfüzyon iyi bir optik sinyal kuracağını bulduk. Ayrıca, en kaliteli gerilim iz edinimi perfüze kalp hareketsiz olmasını gerektirir, aksi takdirde, floresan emisyon değişiklikler güvenilir bir sinyal kayması neden eserler nedeniyle yüksek sadakat ile membran potansiyeli değişiklikleri izlemek için kullanılabilir değildir. Bu, tek bir zirve daha ziyade bir piksel için birden fazla doruklarına neden olacaktır. Optik kayıtlar hareket bozulmaları ortadan kaldırmak için diğer yöntemler mekanik immobilizasyon, diğer uyarım daralma uncouplers (örneğin, blebbistatin cytochalasin D), sinyal işleme tedavisi, matematiksel modelleme [1, 8]. Son olarak, yöntem Burada anlatılan sadece aksiyon potansiyeli epikardiyal kalp yüzeyinde hareket ile ilgili bilgi sağlar. Alternatif doku preparatları ve kızılötesi potansiyometrik boyalar, kalbin diğer bölgelerde elektrik yayılımı özellikleri çözebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Boston Çocuk Hastanesi'nden Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak hayvanlar üzerinde deneyler yapıldı.
Acknowledgments
Ve Boston Çocuk Hastanesi'nden Kalp İletim Fonu katkılar; Bu çalışma, araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüleri hibe (HL088206 HL068915) tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| CardioCMOS-SM128f | Equipment | RedShirtImaging, LLC | ||
| CardioPlex Software | Equipment | RedShirtImaging, LLC | ||
| LUXEON LED Light Source 460-490 nm | Equipment | Lumileds Lighting, US, LLC, San Jose, CA 95131 USA | LXHL-PB02 | |
| ECG Amplifier Type 689 Hugo Sachs Elektronik | Equipment | Harvard Apparatus | 730149 | |
| Dichroic Mirror 505 nm | Equipment | Semrock | FF505-SDi01-25x36 | |
| Emission Filter 605 nm Long Pass | Equipment | SciMedia | ||
| THT Sideways | Equipment | SciMedia | 25 BM-8 | |
| Mini Ball Joint Holder | Equipment | Harvard Apparatus | BS4 73-0177 | |
| Small Stimulation Electrode Set | Equipment | Harvard Apparatus | BS4 73-0160 | |
| BM-6 Benchtop Vibration Isolation Platform | Equipment | Technology Inc., Inglewood, CA 90301 | 25 BM-6 | |
| Monopolar ECG Electrode | Equipment | Harvard Apparatus | BS4 73-0200 | |
| Roller Pump SCI 400 | Equipment | Watson-Marlow Pumps Group | 401U/D1 | |
| Roller Pump MasterFlex Easy Load II | Equipment | Cole-Parmer | Model 77201-60 | |
| Tubing Marprene #14 | Equipment | Watson-Marlow Pumps Group | 902.0016.016 | |
| MasterFlex Tubing | Equipment | PharMed, Westlake, OH 44145 USA | 06485-25 | |
| S48 Square Pulse Stimulator | Equipment | Grass Technologies | Model S48 | |
| SIU5 RF TRANSFORMER ISOLATION UNIT | Equipment | Grass Technologies | Model SIU5 | |
| 5 Liter Water Jacketed Reservoir | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 120142-5 | |
| 2 Liter Water Jacketed Reservoir | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 120142-2 | |
| 0.5 Liter Water Jacketed Reservoir | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 120142-0 | |
| 0.25 Liter Water Jacketed Reservoir | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 120142-025 | |
| 10 ml Heating Coil | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 158822 | |
| Compliance Bubble Trap | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 130149 | |
| Luer Disconnect Cannula | Equipment | Harvard Apparatus | 72-1444 | |
| 3-Way stopcock, FLL to MLT, No Port Covers | Equipment | Harvard Apparatus | BS4 72-2630 | |
| Thermocouple Thermometer | Equipment | Cole-Parmer | WU-91100-40 | |
| Ultra Fine IT-Series Flexible Microprobe | Equipment | PhysiTemp Instruments Inc., Clifton, NJ 07013 USA | IT-24P | |
| Oscilloscope Tektronix TDS 1002 | Equipment | Tektronix, Inc. | TDS 1002B | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Reagent | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| Ketamine HCl | Reagent | Hospira Inc. | RL-0065 | |
| Xylazine | Reagent | Lloyd, Inc. | LB15705A | |
| E-TOXA-CLEAN® | Reagent | Sigma-Aldrich | E9029 | |
| Di-8-ANEPPS | Reagent | Invitrogen | D-3167 |
References
- Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G.
- Hucker, W. J. Images in cardiovascular medicine. Optical mapping of the human atrioventricular junction. Circulation. 117 (11), 1474-147 (2008).
- Entcheva, E., Bien, H. Macroscopic optical mapping of excitation in cardiac cell networks with ultra-high spatiotemporal resolution. Prog Biophys Mol Biol. 92 (2), 232-257 (2006).
- Entcheva, E. Fluorescence imaging of electrical activity in cardiac cells using an all-solid-state system. IEEE Trans Biomed Eng. 51 (2), 333-341 (2004).
- Stamm, C. Rapid endotoxin-induced alterations in myocardial calcium handling: obligatory role of cardiac TNF-alpha. Anesthesiology. 95 (6), 1396-1405 (2001).
- Choi, Y. H. Cardiac conduction through engineered tissue. Am J Pathol. 169 (1), 72-85 (2006).
- Skrzypiec-Spring, M. Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium. J Pharmacol Toxicol Methods. 55 (2), 113-126 (2007).
- Fedorov, V. V. Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts. Heart Rhythm. 4 (5), 619-626 (2007).
