Summary
Dit artikel beschrijft een hoge temporele en ruimtelijke resolutie techniek om optisch image actie potentiaal beweging op het oppervlak van de Langendorff-geperfuseerde rattenharten met behulp van een potentiometrische kleurstof (di-8-ANEPPS).
Abstract
Optische kaart brengen van de cardiale oppervlak met voltage-gevoelige fluorescente kleurstoffen is uitgegroeid tot een belangrijk instrument om elektrische excitatie te onderzoeken in experimentele modellen die variëren in schaal van cel culturen om hele organen
Protocol
Deel 1: Bereid oplossingen en de geïsoleerde doorbloede hart-systeem
- Op de ochtend van het experiment, is 4,0 L van Krebs-Henseleit oplossing, bereid zoals eerder beschreven [5, 6].
- 11 mmol / l 2,3-butaandion monoxime (BDM) wordt opgelost in 1,0 L van Krebs-Henseleit oplossing gedecanteerd van het perfusaat bereid in stap 1.1.
- Een extra 150 ml Krebs-Henseleit is verwijderd uit het perfusaat bereid in stap 1,1 en gemengd met 5 Mol / L di-8-ANEPPS (verdund uit een 10 mmol / L voorraad opgelost in dimethylsulfoxide (DMSO)).
- Deze drie oplossingen worden overgebracht naar watermantel glas reservoirs (Radnoti), waar ze worden voorverwarmd tot 41,0 ° C en zuurstof met een verzonken bubbler (Radnoti) met behulp van 0,2 micrometer-gefilterde 95% O 2, 5% CO 2 gas. Oplossingen van de 3 voorraad reservoirs worden gepompt aan de muur gemonteerde Langendorff systeem met Masterflex ™ L / S peristaltische pompen en een lage absorptie van silicone tubing (Cole-Parmer).
- Voorafgaand aan de montage, is het Langendorff systeem glaswerk (Radnoti) zorgvuldig gewassen met E-Toxa-CLEAN reagens (Sigma-Aldrich) en grondig gespoeld met 0,1 M / L HCl, 100% ethanol, en gedestilleerd water.
- De niet-recirculerende Langendorff apparaat was gebouwd om 70 mm Hg constante druk van 3 verschillende zuurstof reservoirs, die uit het hart van elkaar gescheiden door watermantel verwarmingsspiralen en bubble vallen leveren (Radnoti) [7]. De drie onafhankelijke perfusie lijnen samenkomen boven het hart op twee 3-weg kranen, zodat we nauwkeurig te regelen levering van de oplossingen bereid in stappen 1,1 tot 1,3. Watermantel glaswerk is in serie geschakeld met MASTERFLEX PharMed BPT buis (Cole-Parmer) en verwarmd tot 39 ° C met gedestilleerd water met behulp van twee circulatiepompen E100 (Lauda). Warmteverlies via de platina behandelde silicone pompslang (Cole-Parmer) dat de druk-hoofd reservoirs verbindt met de verwarmingsspiralen en bubble vallen resulteerde in een 37 ° C perfusaat het bereiken van het hart.
Deel 2: Oogst de rat hart en de set-up Langendorff perfusie
- Om een diepe algemene gevoelloosheid veroorzaken in 200-250 g Lewis ratten, is 100 mg / kg ketamine en 10 mg / kg Xylazine geïnjecteerd in de intraperitoneale holte. Aan dit mengsel, voegen we 500 U / kg Heparine om de bloedstolling en myocardischemie te voorkomen tijdens de explantatie procedure.
- Voor eenvoudige toegang tot het hart en de grote vaten, is de voorste borstwand verwijderd. Daarna wordt het omringende weefsel zorgvuldig ontleed en de pericardiale zak geopend.
- Na identificatie van de vena cava inferior, is dit schip afgebonden met 5-0 zijde (Ethicon) en de gehele hart-long block is geëxplanteerd. Weefsel wordt direct geplaatst in ijskoude Krebs-Henseleit oplossing in een 50 mL bekerglas op ijs.
- De opgaande aorta is snel geïdentificeerd en ontleed van het omringende weefsel. Een voldoende grote canule (Harvard Apparatus) wordt ingebracht in de aorta, zorg om te voorkomen dat het onderbreken van de verplichte perfusie van de kransslagaders door het inbrengen van de canule te ver in de aorta wortel. De canule is bevestigd aan de aorta ascendens met 5-0 zijde (Ethicon).
- De rat hart wordt dan geplaatst op het Langendorff apparaat zonder dat er luchtbellen in de canule. Retrograde coronaire vasculaire perfusie is nu gevestigd aan de warme, zuurstofrijke Krebs-Henseleit oplossing uit de druk-head beschreven in stap 1.6.
- Extra weefsel, waaronder de longen, is nu verwijderd en het hart is perfusie gedurende 20 minuten tot herstel van functie mogelijk te maken en het ritme te stabiliseren. Gedurende deze tijd, is een zeer dunne thermokoppel temperatuurvoeler (Cole-Parmer) ingebracht in de linker ventrikel holte en gehecht op zijn plaats met 5-0 Prolene hechting (Ethicon). De sonde is verbonden met een thermo-controller (Digi-Sense) om de temperatuur van het hart verzekeren wordt gehandhaafd op 37 ° C door het aanpassen van de instellingen van het water bloedsomloop pompen. Beweging van perfusaat druipen van de hart-top wordt geminimaliseerd door het plaatsen van een gaasje in het effluent bakje.
Deel 3: Laad hart met potentiometrische kleurstof en het verwerven elektrografisch en optische signalen
- Di-8-ANEPPS (Invitrogen) wordt geladen in het hart door over te schakelen naar de perfusie regel met de Krebs-Henseleit gemengd met de fluorescente kleurstof met behulp van een kraan. Daarnaast wordt een canule 18G geplaatst in de linker-en / of rechts atrium en extra 50 ml kleurstof oplossing wordt langzaam toegediend in elk van deze kamers, omdat ze niet voldoende geperfuseerd met kleurstof geïntroduceerd door de kransslagaders.
- Tijdens het laden procedure worden drie ECG leads (Harvard Apparatus) voorzichtig geplaatst op het oppervlak van het hart dat niet is geconfronteerd met de optiek gebruikt voor mapping. Elektrode N o 1 is geplaatst op het achterste apicale deel van de linker ventrikel, N o 2 aan de linker atrium, en N
- ECG-versterker (Hugo Sachs Elektronik) instellingen: High Pass Filter: 0,1 Hz
Low Pass Filter: 150 Hz - De CMOS-camera (RedShirt Imaging) en macroscoop wordt gepositioneerd met behulp van de XYZ-aanpassingen, zodat het oppervlak van het hart is in focus en in het midden van de overname frame. De camera en lenzen zijn gemonteerd op een trillingsisolatie tafel (Minus K Technology) aan resonantiefrequenties te minimaliseren. Op hetzelfde moment, een coaxiale pacing elektrode (Harvard Apparatus) gecontroleerd met een geïsoleerde, S48 elektrische stimulatie-unit (Grass), wordt geplaatst op de rechter atrium en het hart wordt gestimuleerd met 300 slagen per minuut (figuur 1).
- Elektrische stimulatie (Grass) instellingen:
Prijs: 5 pulsen per seconde
Vertraging: 0,2 ms
Duur: 2 ms
Volt: 6-12 V
Mode: Herhaal
Pulse: Single - Voor optische opnames, die bewegingsartefacten gebrek van samentrekking, het hart moet elektromechanisch worden ontkoppeld. Dit doen we door opnieuw te schakelen perfusie lijnen naar Krebs-Henseleit oplossing die 11 mmol / l BDM bevat. Tussen de overnames, is het hart geperfuseerd met onvervalste Krebs-Henseleit om te helpen levensvatbaarheid van het preparaat te behouden.
- De opname parameters worden ingesteld met behulp van de software (RedShirt Imaging) met de volgende overname instellingen:
Configuratie: 2000 Hz; 128x128 pixel array-
Frame Interval: 0,5 ms
Camera Amplifier Gain: 5x
On-Chip Gain: 8x-12Me-well
Sluiter: 500 ms vertraging
Aantal frames: 4000
Duur: 2000 ms - Alle kamers en apparatuur verlichting uitgeschakeld of afgeschermd om achtergrondgeluid te elimineren tijdens het opnemen. Het LED-lampje verlicht het hart alleen tijdens de optische opname te verminderen foto-bleken en kleurstof toxiciteit. De lichtbron sluiter wordt bediend met een 5 V-puls geleverd via het bedieningspaneel door middel van een D-to-Een bord in de computer (RedShirt Imaging).
Deel 4: Analyseer acquisitie informatie met behulp van RedShirt Imaging Software
- Na de overname, worden de gegevens verwerkt met behulp van verschillende instellingen van het filter. We maken doorgaans gebruik van de standaardinstellingen, behalve wanneer het aanpassen van de Band Stop / Pass-filter, die is ingesteld met de linker grens op 44,0 en de juiste grens op 98,0. Daarna de opgenomen informatie wordt verwerkt en een film is gegenereerd (RedShirt Imaging).
- Gegevens van een acquisitie komt overeen met de lokale elektrische activering op 16.384 plaatsen op het hart oppervlak over een periode van 2 seconden. De software laat deze lokale signalen direct worden vergeleken met elkaar en met de atriale en ventriculaire elektrografisch opnames. Gegevens worden vervolgens gevisualiseerd door in kaart brengen van de lokale elektrische activering van kleur en weergave van deze informatie als een animatie van de spatiotemporele elektrische activering op de cardiale oppervlak. Voor het maken van zo'n animatie, gebruiken we de software:
- tijdelijk en / of ruimtelijk de gegevens filteren
- selecteert u een begin-en eindtijd voor de animatie
- kaart optische signalen naar kleur op basis van rust de lichtsterkte van elke pixel
- overlay van de resulterende kleur gegevens met een foto van het hart
- het genereren van de animatie
Deel 5: Representatieve resultaten
Als de doorbloede hart preparaat werd doodstil tijdens de opname, de optische signalen tonen een duidelijke piek voor elke pixel die betrokken zijn bij een verandering van de emissie-intensiteit van de di-8-ANEPPS. De bijbehorende films (figuren 3 en 4) aan te tonen een excitatie golffront verspreiden over het epicardiale oppervlak van het hart als de gelijktijdig verworven elektrografische-opnamen (figuur 2).
Figuur 1. Een foto van een Langendorff-doorbloed hart voorbereiding beeltenis van de posities van de pacing elektrode op de juiste atrium en de ECG afleidingen zoals beschreven in stap 3.2.
Figuur 2. Vertegenwoordiger van optische signalen en elektrografische opnames van een perfusie Lewis rat hart. Paneel A toont een beeld van de epicardiale oppervlakte wordt gebruikt voor optische beeldvorming. De positie van de pixels geselecteerd om de veranderingen in fluorescentie-emissie in de tijd Panel B aan te tonen zijn aangegeven met gekleurde pijlen. Elektrografische signalen worden getoond in Panel C met de rode lijn die aangeeft atriale activering en de licht blauwe lijn die overeenkomt met de ventriculaire signaal. Alstublieftve.com/files/ftp_upload/1138/Figure4.jpg "> klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Wegnemen van het hart van de verdoofde ratten snel moeten worden uitgevoerd om myocardischemie te voorkomen. Als ischemie of onvoldoende coronaire perfusie optreedt, zal het hart waarschijnlijk ontwikkelen aritmieën en kan worden infarct. Daarnaast zullen deze harten tonen onvoldoende fluorescentie-emissie voor informatieve opnames en de daarop volgende analyses. Voor het laden van de kleurstof, myocardcellen moeten adequaat worden geperfuseerd met Krebs-Henseleit oplossing om vast te stellen en onderhouden van een fysiologische elektrolyt milieu voor de stabiliteit van elektrische impulsen. Nauwkeurige voorbereiding van het perfusaat is ook nodig om een goede organen levensvatbaarheid en functie te behouden. Verschillen in de elektrolyt concentratie of onvoldoende filtering van het perfusaat zal waarschijnlijk leiden tot fatale myocard dysfunctie en hartritmestoornissen. Voor de optische opnames, moet het hart volledig geladen met voltage-gevoelige kleurstof. Dit is vooral belangrijk voor de atriale myocard als deze kamers zijn niet goed doorbloed door de kransslagaders. We hebben gemerkt dat er extra intra-cavitary perfusie van de atria zullen een goede optische signaal vast te stellen. Bovendien maakt de verwerving van top-kwaliteit spanning tracings vereist dat de doorbloede hart te onbeweeglijk, anders, veranderingen in fluorescentie-emissie niet betrouwbaar kan worden gebruikt om veranderingen in de membraanpotentiaal track met high-fidelity te wijten aan artefacten worden veroorzaakt door het signaal drift. Dit zal resulteren in meerdere pieken voor een pixel in plaats van een enkele piek. Andere methoden om bewegingsartefacten te elimineren van optische opnames zijn mechanische immobilisatie, behandeling met andere excitatie-contractie uncouplers (bijv. cytochalasine D, blebbistatin), signaalverwerking, en door wiskundige modellering [1, 8]. Ten slotte is de hier beschreven methode alleen biedt informatie over de actie potentiaal beweging op het hart epicardiale oppervlak. Alternatief weefsel voorbereidingen en infrarood potentiometrische kleurstoffen kunnen het oplossen van de elektrische propagatie kenmerken in andere regio's van het hart.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Experimenten op dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften uiteengezet door de Institutional Animal Care en gebruik Comite op Children's Hospital Boston in te stellen.
Acknowledgments
Dit werk wordt ondersteund door subsidies voor onderzoek van de National Institutes of Health (HL068915, HL088206) en bijdragen aan het hartgeleiding Fonds op Children's Hospital Boston.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| CardioCMOS-SM128f | Equipment | RedShirtImaging, LLC | ||
| CardioPlex Software | Equipment | RedShirtImaging, LLC | ||
| LUXEON LED Light Source 460-490 nm | Equipment | Lumileds Lighting, US, LLC, San Jose, CA 95131 USA | LXHL-PB02 | |
| ECG Amplifier Type 689 Hugo Sachs Elektronik | Equipment | Harvard Apparatus | 730149 | |
| Dichroic Mirror 505 nm | Equipment | Semrock | FF505-SDi01-25x36 | |
| Emission Filter 605 nm Long Pass | Equipment | SciMedia | ||
| THT Sideways | Equipment | SciMedia | 25 BM-8 | |
| Mini Ball Joint Holder | Equipment | Harvard Apparatus | BS4 73-0177 | |
| Small Stimulation Electrode Set | Equipment | Harvard Apparatus | BS4 73-0160 | |
| BM-6 Benchtop Vibration Isolation Platform | Equipment | Technology Inc., Inglewood, CA 90301 | 25 BM-6 | |
| Monopolar ECG Electrode | Equipment | Harvard Apparatus | BS4 73-0200 | |
| Roller Pump SCI 400 | Equipment | Watson-Marlow Pumps Group | 401U/D1 | |
| Roller Pump MasterFlex Easy Load II | Equipment | Cole-Parmer | Model 77201-60 | |
| Tubing Marprene #14 | Equipment | Watson-Marlow Pumps Group | 902.0016.016 | |
| MasterFlex Tubing | Equipment | PharMed, Westlake, OH 44145 USA | 06485-25 | |
| S48 Square Pulse Stimulator | Equipment | Grass Technologies | Model S48 | |
| SIU5 RF TRANSFORMER ISOLATION UNIT | Equipment | Grass Technologies | Model SIU5 | |
| 5 Liter Water Jacketed Reservoir | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 120142-5 | |
| 2 Liter Water Jacketed Reservoir | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 120142-2 | |
| 0.5 Liter Water Jacketed Reservoir | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 120142-0 | |
| 0.25 Liter Water Jacketed Reservoir | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 120142-025 | |
| 10 ml Heating Coil | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 158822 | |
| Compliance Bubble Trap | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 130149 | |
| Luer Disconnect Cannula | Equipment | Harvard Apparatus | 72-1444 | |
| 3-Way stopcock, FLL to MLT, No Port Covers | Equipment | Harvard Apparatus | BS4 72-2630 | |
| Thermocouple Thermometer | Equipment | Cole-Parmer | WU-91100-40 | |
| Ultra Fine IT-Series Flexible Microprobe | Equipment | PhysiTemp Instruments Inc., Clifton, NJ 07013 USA | IT-24P | |
| Oscilloscope Tektronix TDS 1002 | Equipment | Tektronix, Inc. | TDS 1002B | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Reagent | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| Ketamine HCl | Reagent | Hospira Inc. | RL-0065 | |
| Xylazine | Reagent | Lloyd, Inc. | LB15705A | |
| E-TOXA-CLEAN® | Reagent | Sigma-Aldrich | E9029 | |
| Di-8-ANEPPS | Reagent | Invitrogen | D-3167 |
References
- Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G.
- Hucker, W. J. Images in cardiovascular medicine. Optical mapping of the human atrioventricular junction. Circulation. 117 (11), 1474-147 (2008).
- Entcheva, E., Bien, H. Macroscopic optical mapping of excitation in cardiac cell networks with ultra-high spatiotemporal resolution. Prog Biophys Mol Biol. 92 (2), 232-257 (2006).
- Entcheva, E. Fluorescence imaging of electrical activity in cardiac cells using an all-solid-state system. IEEE Trans Biomed Eng. 51 (2), 333-341 (2004).
- Stamm, C. Rapid endotoxin-induced alterations in myocardial calcium handling: obligatory role of cardiac TNF-alpha. Anesthesiology. 95 (6), 1396-1405 (2001).
- Choi, Y. H. Cardiac conduction through engineered tissue. Am J Pathol. 169 (1), 72-85 (2006).
- Skrzypiec-Spring, M. Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium. J Pharmacol Toxicol Methods. 55 (2), 113-126 (2007).
- Fedorov, V. V. Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts. Heart Rhythm. 4 (5), 619-626 (2007).
