Summary
यह आलेख ऑप्टिकली Langendorff perfused चूहे एक potentiometric डाई (di 8 ANEPPS) का उपयोग दिल की सतह पर छवि कार्रवाई संभावित आंदोलन के लिए एक उच्च अस्थायी और स्थानिक संकल्प तकनीक का वर्णन करता है.
Protocol
भाग 1: तैयार करें और अलग समाधान perfused दिल प्रणाली
- प्रयोग की सुबह क्रेब्स - Henseleit समाधान के 4.0 एल के रूप में पहले [5 6] वर्णित तैयार है.
- 11 mmol / एल 2,3 butanedione monoxime (BDM) क्रेब्स Henseleit 1.1 चरण में तैयार perfusate से decanted समाधान के 1.0 एल में भंग कर रहा है.
- क्रेब्स Henseleit के एक अतिरिक्त 150 एमएल 1.1 चरण में तैयार perfusate से निकाल दिया जाता है और 5 Mol / एल di-8 ANEPPS (एक 10 mmol / एल डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) में भंग शेयर से पतला) के साथ मिश्रित है.
- 5% सीओ 2 गैस, इन 3 समाधान पानी तख्ताबंदीवाला कांच (Radnoti) जलाशयों, जहां वे कर रहे हैं 41.0 ° C पूर्व गर्म और एक जलमग्न (Radnoti) bubbler 0.2 का उपयोग कर 95% 2 हे सुक्ष्ममापी फ़िल्टर के साथ oxygenated स्थानांतरित कर रहे हैं. 3 शेयर जलाशयों से समाधान MasterFlex ™ एल / एस क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप और कम अवशोषण सिलिकॉन टयूबिंग (कोल-Parmer) के साथ दीवार पर चढ़कर Langendorff प्रणाली के लिए पंप हैं.
- विधानसभा के लिए पहले, Langendorff प्रणाली कांच के बने पदार्थ (Radnoti) कुशलता से ई TOXA स्वच्छ अभिकर्मक (सिग्मा Aldrich) के साथ धोया जाता है और अच्छी तरह से 0.1 एम / एल एचसीएल, 100% इथेनॉल, और आसुत जल के साथ rinsed.
- 70 मिमी Hg 3 अलग oxygenated जलाशयों, जो दिल से पानी तख्ताबंदीवाला हीटिंग coils और बुलबुला जाल के साथ अलग कर रहे हैं से दबाव लगातार देने के लिए गैर - recirculating Langendorff तंत्र का निर्माण किया गया था ( Radnoti) [7] 3 स्वतंत्र छिड़काव लाइनों दो तीन तरह stopcocks पर दिल से ऊपर एकाग्र, हमें ठीक 1,3 करने के लिए 1,1 चरणों में तैयार समाधान के वितरण को नियंत्रित करने के लिए अनुमति देता है. जल - तख्ताबंदीवाला कांच के बने पदार्थ MasterFlex फार्म्ड बीपीटी टयूबिंग (कोल-Parmer) के साथ श्रृंखला में जुड़ा हुआ है और 39 को गरम डिग्री सेल्सियस आसुत पानी का उपयोग कर दो E100 circulators (Lauda) के साथ. प्लैटिनम ठीक हो सिलिकॉन टयूबिंग (कोल-Parmer) हीटिंग coils और बुलबुला जाल करने के लिए दबाव सिर जलाशयों को जोड़ता के माध्यम से हीट हानि डिग्री सेल्सियस perfusate दिल तक पहुँचने के 37 में हुई.
भाग 2: फसल काटने वाले चूहे दिल और सेट - अप Langendorff छिड़काव
- 200-250 ग्राम लुईस चूहों में गहरी सामान्य संज्ञाहरण प्रेरित, 100 Ketamine मिलीग्राम / किग्रा और 10 Xylazine मिलीग्राम / किग्रा intraperitoneal गुहा में अंतःक्षिप्त है. इस मिश्रण करने के लिए, हम 500 U / किग्रा explantation प्रक्रिया के दौरान रक्त जमावट और myocardial ischemia रोकने के हेपरिन जोड़ें.
- दिल और महान जहाजों के लिए आसान पहुँच के लिए पूर्वकाल छाती दीवार निकाल दिया जाता है. उसके बाद, आसपास के ऊतकों को ध्यान से dissected है और pericardial बोरी खोला.
- अवर रग Cava की पहचान के बाद, 5-0 (Ethicon) रेशम और पूरे दिल फेफड़ों ब्लॉक explanted है के साथ इस पोत ligated है. ऊतक तुरंत ठंडा क्रेब्स Henseleit बर्फ पर 50 एमएल बीकर में निहित समाधान में रखा गया है.
- आरोही महाधमनी जल्दी पहचान की है और आसपास के ऊतकों से dissected. एक उचित आकार के प्रवेशनी महाधमनी (हार्वर्ड उपकरण) में डाला जाता है, देखभाल लेने के लिए बहुत दूर महाधमनी जड़ में डालने प्रवेशनी द्वारा कोरोनरी धमनियों की अनिवार्य छिड़काव दखल से बचने. प्रवेशनी 5-0 रेशम (Ethicon) के साथ आरोही महाधमनी के लिए सुरक्षित है.
- चूहे दिल तो प्रवेशनी में हवा बुलबुले शुरू के बिना Langendorff तंत्र पर रखा. प्रतिगामी कोरोनरी संवहनी छिड़काव अब गर्म, oxygenated 1.6 चरण में वर्णित दबाव सिर से समाधान क्रेब्स Henseleit के साथ स्थापित है.
- फेफड़ों सहित अतिरिक्त ऊतक, अब हटा दिया है और 20 मिनट के लिए दिल perfused समारोह की वसूली की अनुमति के लिए और स्थिर ताल. इस समय के दौरान, एक बहुत पतली thermocouple तापमान जांच (कोल-Parmer) बाएं निलय गुहा में शुरू की है और 5-0 Prolene सीवन (Ethicon) के साथ जगह में sutured. जांच थर्मामीटरों नियंत्रक (Digi-नब्ज) जुड़ा हुआ है दिल के तापमान सुनिश्चित करने के 37 में बनाए रखा है ° सी जल परिसंचरण पंप के सेटिंग्स का समायोजन करके. हृदय शीर्ष से टपकता perfusate से मोशन प्रवाह गोदाम में धुंध का एक टुकड़ा रखकर कम से कम है.
भाग 3: potentiometric डाई के साथ लोड दिल और electrographic और ऑप्टिकल संकेतों अधिग्रहण
- डि-8-ANEPPS (Invitrogen) दिल में छिड़काव फ्लोरोसेंट डाई का उपयोग कर एक पानी निकलने की टोंटी के साथ मिश्रित क्रेब्स - Henseleit युक्त लाइन करने के लिए स्विचन से भरी हुई है. इसके अलावा, एक 18G प्रवेशनी छोड़ दिया और / या दाएँ और डाई समाधान के अतिरिक्त 50 एमएल आलिंद में रखा गया है धीरे धीरे इन कक्षों में से प्रत्येक में प्रशासित क्योंकि वे पर्याप्त कोरोनरी धमनियों के माध्यम से शुरू डाई के साथ perfused नहीं कर रहे हैं.
- लदान प्रक्रिया के दौरान, 3 ईसीजी सुराग (हार्वर्ड उपकरण) को धीरे से दिल है कि मानचित्रण के लिए इस्तेमाल किया प्रकाशिकी नहीं सामना करना पड़ रहा है की सतह पर रखा जाता है. इलेक्ट्रोड एन ओ एक बाएं वेंट्रिकल के शिखर पीछे भाग, एन ओ बाएं आलिंद पर 2, और एन पर तैनात है
- उच्च पास फ़िल्टर:: 0.1 हर्ट्ज ईसीजी प्रवर्धक (ह्यूगो सैक्स Elektronik) सेटिंग्स
कम पास फ़िल्टर: 150 हर्ट्ज - CMOS (redshirt इमेजिंग) कैमरा और macroscope XYZ समायोजन का उपयोग कर तैनात है ताकि दिल की सतह ध्यान में है और अधिग्रहण फ्रेम में केन्द्रित है. कैमरा और प्रकाशिकी एक कंपन अलगाव (ऋण कश्मीर प्रौद्योगिकी) तालिका गूंजनेवाला आवृत्तियों को कम करने पर बढ़ रहे हैं. इसी समय, एक समाक्षीय पेसिंग इलेक्ट्रोड (हार्वर्ड उपकरण) एक अलग, S48 इकाई बिजली उत्तेजना (घास) के साथ नियंत्रित है, सही atrium पर रखा और दिल प्रति मिनट 300 धड़क रहा है (चित्रा 1) पर पुस्तक है.
- बिजली उत्तेजना सेटिंग्स (घास):
दर: प्रति सेकंड 5 दालों
देरी: 0.2 एमएस
अवध्ि: 2 एमएस
वोल्ट: 6-12 वी
विधि: दोहराएँ
पल्स: सिंगल - ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग जो संकुचन से गति कलाकृतियों की कमी के लिए, हृदय Electromechanically uncoupled की जरूरत है. हम फिर से क्रेब्स - Henseleit समाधान है कि 11 mmol / एल BDM होता छिड़काव लाइनों स्विचन द्वारा इस करते हैं. अधिग्रहण के बीच, दिल के साथ चापलूसी नहीं क्रेब्स - Henseleit perfused तैयार करने की व्यवहार्यता की रक्षा में मदद.
- रिकॉर्डिंग पैरामीटर निम्न अधिग्रहण सेटिंग्स के साथ सॉफ्टवेयर (redshirt इमेजिंग) का उपयोग कर सेट कर रहे हैं:
विन्यास: 2,000 हर्ट्ज, 128x128 पिक्सेल सरणी
फ्रेम अंतराल: एमएस 0.5
कैमरा प्रवर्धक लाभ: 5x
पर चिप लाभ: 8x 12Me - अच्छी तरह से
शटर: 500 एमएस देरी
फ्रेम्स की संख्या: 4000
अवधि: 2000 एमएस - सभी कमरे और उपकरण रोशनी बंद कर दिया जाता है या रिकॉर्डिंग के दौरान पृष्ठभूमि शोर को समाप्त करने के लिए परिरक्षित. एलईडी प्रकाश ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग के दौरान ही दिल illuminates तस्वीर विरंजन और डाई विषाक्तता कम है. प्रकाश स्रोत शटर एक 5 वी नियंत्रण कक्ष के माध्यम से एक डी कंप्यूटर में बोर्ड (redshirt इमेजिंग) के माध्यम से वितरित की नाड़ी के साथ नियंत्रित किया जाता है.
भाग 4: अधिग्रहण redshirt इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर जानकारी का विश्लेषण
- अधिग्रहण के बाद, डेटा विभिन्न फ़िल्टर सेटिंग्स का उपयोग संसाधित किया जाता है. हम आम तौर पर जब बैंड बंद करो / दर्रा फिल्टर, जो 44.0 पर बाईं सीमा और 98.0 पर सही सीमा के साथ सेट कर दिया जाता है समायोजन को छोड़कर डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स का उपयोग करें. बाद में दर्ज जानकारी संसाधित है और एक फिल्म (redshirt इमेजिंग) उत्पन्न होता है.
- डेटा एक अधिग्रहण से 2 सेकंड की अवधि में 16,384 दिल की सतह पर साइटों पर स्थानीय बिजली के सक्रियण के लिए मेल खाती है. सॉफ्टवेयर इन स्थानीय संकेतों को सीधे एक दूसरे के साथ और आलिंद और निलय electrographic रिकॉर्डिंग के साथ तुलना की अनुमति देता है. डेटा है तो रंग के लिए स्थानीय बिजली सक्रियण मानचित्रण और हृदय की सतह पर spatiotemporal बिजली सक्रियण दिखा एनीमेशन के रूप में इस जानकारी प्रतिपादन द्वारा कल्पना. इस तरह के एक एनीमेशन बनाने के लिए, हम करने के लिए सॉफ्टवेयर का उपयोग:
- अस्थायी और / या स्थानिक डेटा फ़िल्टर
- एनीमेशन के लिए प्रारंभ और समाप्ति समय का चयन करें
- नक्शा रंग के लिए ऑप्टिकल संकेतों आराम प्रत्येक पिक्सेल के प्रकाश की तीव्रता के आधार पर
- दिल की एक तस्वीर के साथ जिसके परिणामस्वरूप रंग डेटा उपरिशायी
- एनीमेशन उत्पन्न
भाग 5: प्रतिनिधि के परिणाम
यदि perfused दिल तैयारी रिकॉर्डिंग के दौरान स्तब्ध था, ऑप्टिकल संकेतों di-8-ANEPPS के उत्सर्जन तीव्रता का एक परिवर्तन में शामिल प्रत्येक पिक्सेल के लिए एक अलग शिखर दिखा. इसी फिल्में (3 आंकड़े और 4) एक उत्तेजना की लहर सामने दिल के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक साथ अधिग्रहीत electrographic रिकॉर्डिंग (चित्रा 2) के epicardial सतह भर में प्रचार प्रदर्शित करता है.
चित्रा 1 एक दिल Langendorff perfused तैयारी की एक तस्वीर सही atrium पर पेसिंग इलेक्ट्रोड के पदों चित्रण और ईसीजी कदम 3.2 में वर्णित के रूप में सुराग.
चित्रा 2 प्रतिनिधि ऑप्टिकल और एक perfused लुईस चूहे दिल से संकेत electrographic रिकॉर्डिंग. कक्ष एक epicardial ऑप्टिकल इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया सतह की एक छवि से पता चलता है. पैनल बी में समय पर प्रतिदीप्ति उत्सर्जन में परिवर्तन को प्रदर्शित करने के लिए चयनित पिक्सल की स्थिति रंगीन तीर द्वारा संकेत कर रहे हैं. Electrographic संकेतों पैनल सी में लाल आलिंद सक्रियण और हल्के नीले निलय संकेत करने के लिए इसी लाइन का संकेत लाइन के साथ दिखाया जाता है. कृपयाve.com/files/ftp_upload/1138/Figure4.jpg "> यहाँ क्लिक करें यह आंकड़ा एक बड़ा संस्करण देख.
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Discussion
दिल की anesthetized चूहों से हटाया तेजी से प्रदर्शन किया जाना चाहिए myocardial ischemia से बचने के. यदि ischemia या अपर्याप्त कोरोनरी छिड़काव होता है, दिल की संभावना arrhythmias विकास और infarcted बन सकता है. इसके अतिरिक्त, इन दिल जानकारीपूर्ण रिकॉर्डिंग और बाद के विश्लेषण के लिए अपर्याप्त प्रतिदीप्ति उत्सर्जन दिखाएगा. डाई लोड हो रहा से पहले, दौरे कोशिकाओं को पर्याप्त रूप से क्रेब्स - Henseleit समाधान के साथ perfused करने की आवश्यकता है स्थापित करने और बिजली के उद्यमी की स्थिरता के लिए एक शारीरिक इलेक्ट्रोलाइट वातावरण बनाए रखने के है. Perfusate की सटीक तैयारी भी उचित अंग व्यवहार्यता और समारोह को बनाए रखने के लिए आवश्यक है. इलेक्ट्रोलाइट एकाग्रता या perfusate की अपर्याप्त फ़िल्टरिंग में अंतर शायद घातक myocardial रोग और दिल ताल विकारों के लिए नेतृत्व करेंगे. ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग के लिए, दिल पूरी तरह से वोल्टेज के प्रति संवेदनशील डाई के साथ लोड किया जाना चाहिए. इस atrial मायोकार्डियम के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है के रूप में इन कक्षों कोरोनरी धमनियों द्वारा अच्छी तरह से perfused हैं. हमने पाया है कि atria के अतिरिक्त अंतर cavitary छिड़काव एक अच्छा ऑप्टिकल संकेत स्थापित करेगा. इसके अलावा, शीर्ष गुणवत्ता वोल्टेज tracings के अधिग्रहण के perfused दिल स्थिर होना करने की आवश्यकता है है, अन्यथा, प्रतिदीप्ति उत्सर्जन में परिवर्तन मज़बूती से उच्च संकेत बहाव की वजह से कलाकृतियों के लिए कारण निष्ठा के साथ झिल्ली क्षमता में परिवर्तन ट्रैक नहीं इस्तेमाल किया जा सकता है. यह कई चोटियों में बजाय एक एकल चोटी एक पिक्सेल के लिए परिणाम होगा. ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग से गति कलाकृतियों को खत्म करने के अन्य तरीकों यांत्रिक स्थिरीकरण, अन्य उत्तेजना - संकुचन (cytochalasin विकास जैसे, blebbistatin) uncouplers, सिग्नल प्रोसेसिंग के साथ उपचार, और गणितीय मॉडलिंग [1 8 ] शामिल हैं. अंत में, विधि यहाँ वर्णित केवल हृदय epicardial सतह पर कार्रवाई संभावित आंदोलन के बारे में जानकारी प्रदान करता है. वैकल्पिक ऊतक की तैयारियाँ और अवरक्त potentiometric रंजक दिल के अन्य क्षेत्रों में बिजली के प्रचार विशेषताओं हल हो सकती है.
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Disclosures
जानवरों पर प्रयोग संस्थागत पशु की देखभाल और बच्चों के अस्पताल के बोस्टन में उपयोग समिति द्वारा निर्धारित दिशा निर्देशों और नियमों के अनुसार में प्रदर्शन किया गया.
Acknowledgments
और बच्चों के अस्पताल के बोस्टन में हृदय चालन फंड के लिए योगदान, इस काम के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों से अनुसंधान अनुदान (HL088206 HL068915) द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| CardioCMOS-SM128f | Equipment | RedShirtImaging, LLC | ||
| CardioPlex Software | Equipment | RedShirtImaging, LLC | ||
| LUXEON LED Light Source 460-490 nm | Equipment | Lumileds Lighting, US, LLC, San Jose, CA 95131 USA | LXHL-PB02 | |
| ECG Amplifier Type 689 Hugo Sachs Elektronik | Equipment | Harvard Apparatus | 730149 | |
| Dichroic Mirror 505 nm | Equipment | Semrock | FF505-SDi01-25x36 | |
| Emission Filter 605 nm Long Pass | Equipment | SciMedia | ||
| THT Sideways | Equipment | SciMedia | 25 BM-8 | |
| Mini Ball Joint Holder | Equipment | Harvard Apparatus | BS4 73-0177 | |
| Small Stimulation Electrode Set | Equipment | Harvard Apparatus | BS4 73-0160 | |
| BM-6 Benchtop Vibration Isolation Platform | Equipment | Technology Inc., Inglewood, CA 90301 | 25 BM-6 | |
| Monopolar ECG Electrode | Equipment | Harvard Apparatus | BS4 73-0200 | |
| Roller Pump SCI 400 | Equipment | Watson-Marlow Pumps Group | 401U/D1 | |
| Roller Pump MasterFlex Easy Load II | Equipment | Cole-Parmer | Model 77201-60 | |
| Tubing Marprene #14 | Equipment | Watson-Marlow Pumps Group | 902.0016.016 | |
| MasterFlex Tubing | Equipment | PharMed, Westlake, OH 44145 USA | 06485-25 | |
| S48 Square Pulse Stimulator | Equipment | Grass Technologies | Model S48 | |
| SIU5 RF TRANSFORMER ISOLATION UNIT | Equipment | Grass Technologies | Model SIU5 | |
| 5 Liter Water Jacketed Reservoir | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 120142-5 | |
| 2 Liter Water Jacketed Reservoir | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 120142-2 | |
| 0.5 Liter Water Jacketed Reservoir | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 120142-0 | |
| 0.25 Liter Water Jacketed Reservoir | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 120142-025 | |
| 10 ml Heating Coil | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 158822 | |
| Compliance Bubble Trap | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 130149 | |
| Luer Disconnect Cannula | Equipment | Harvard Apparatus | 72-1444 | |
| 3-Way stopcock, FLL to MLT, No Port Covers | Equipment | Harvard Apparatus | BS4 72-2630 | |
| Thermocouple Thermometer | Equipment | Cole-Parmer | WU-91100-40 | |
| Ultra Fine IT-Series Flexible Microprobe | Equipment | PhysiTemp Instruments Inc., Clifton, NJ 07013 USA | IT-24P | |
| Oscilloscope Tektronix TDS 1002 | Equipment | Tektronix, Inc. | TDS 1002B | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Reagent | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| Ketamine HCl | Reagent | Hospira Inc. | RL-0065 | |
| Xylazine | Reagent | Lloyd, Inc. | LB15705A | |
| E-TOXA-CLEAN® | Reagent | Sigma-Aldrich | E9029 | |
| Di-8-ANEPPS | Reagent | Invitrogen | D-3167 |
References
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- Hucker, W. J. Images in cardiovascular medicine. Optical mapping of the human atrioventricular junction. Circulation. 117 (11), 1474-147 (2008).
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- Entcheva, E. Fluorescence imaging of electrical activity in cardiac cells using an all-solid-state system. IEEE Trans Biomed Eng. 51 (2), 333-341 (2004).
- Stamm, C. Rapid endotoxin-induced alterations in myocardial calcium handling: obligatory role of cardiac TNF-alpha. Anesthesiology. 95 (6), 1396-1405 (2001).
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- Skrzypiec-Spring, M. Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium. J Pharmacol Toxicol Methods. 55 (2), 113-126 (2007).
- Fedorov, V. V. Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts. Heart Rhythm. 4 (5), 619-626 (2007).
