Summary
Dieser Artikel beschreibt ein hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung Technik optisch Bild Aktionspotential Bewegung auf der Oberfläche von Langendorff-perfundierten Rattenherzen mit einem potentiometrischen Farbstoff (di-8-ANEPPS).
Abstract
Optische Abbildung der Herz-Oberfläche mit Spannungs-Fluoreszenzfarbstoffe ist zu einem wichtigen Werkzeug, um elektrische Erregung in experimentellen Modellen zu untersuchen, die Reichweite in der Skala von Zellkulturen ganzen Organe
Protocol
Teil 1: Bereiten Sie Lösungen und der isoliert perfundierten Herzen System
- Am Morgen des Experiments beträgt 4,0 L von Krebs-Henseleit-Lösung hergestellt wie zuvor beschrieben [5, 6] beschrieben.
- 11 mmol / L 2,3-Butandion Monoxim (BDM) ist in 1,0 L von Krebs-Henseleit-Lösung aus dem Perfusat in Schritt 1.1 hergestellten dekantiert aufgelöst.
- Eine zusätzliche 150 ml Krebs-Henseleit ist aus dem Perfusat in Schritt 1.1 hergestellten entfernt und mit 5 mol / l di-8-ANEPPS (verdünnt aus einer 10 mmol / L Lager in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst).
- 5% CO 2-Gas; Diese 3 Lösungen sind auf Wasser-ummantelten Glas Reservoire (Radnoti), wo sie sind auf 41,0 ° C vorgewärmt und mit Sauerstoff mit einem getauchten Bubbler (Radnoti) mit 0,2 um-gefiltert 95% O 2 übertragen. Lösungen aus den 3 stock Stauseen an der Wand montiert Langendorff-System mit Masterflex ™ L / S Schlauchpumpen und Low-Absorption Silikonschlauch (Cole-Parmer) gepumpt.
- Vor der Montage ist die Langendorff System Glaswaren (Radnoti) sorgfältig mit E-TOXA-CLEAN-Reagenz (Sigma-Aldrich) gewaschen und gründlich mit 0,1 M / L HCl, 100% Ethanol und destilliertem Wasser gespült.
- Die Nicht-Rückführung Langendorff-Apparatur wurde konstruiert, um 70 mm Hg bei konstantem Druck von 3 separate Sauerstoff Stauseen, die aus dem Herzen mit Wassermantel Heizschlangen und Blasenfallen getrennt zu liefern (Radnoti) [7]. Die 3 unabhängigen Perfusion Linien oberhalb des Herzens in zwei 3-Wege-Hähne konvergieren, so dass wir genau kontrollieren Lieferung der Lösungen in Schritten von 1,1 bis 1,3 zubereitet. Wasser-ummantelte Glas wird in Reihe mit Masterflex PharMed BPT-Schläuche (Cole-Parmer) angeschlossen und erwärmt auf 39 ° C mit destilliertem Wasser mit zwei E100-Umwälzpumpen (Lauda). Der Wärmeverlust durch die platin-veredelten Silikonschlauch (Cole-Parmer), dass der Druck-Kopf-Reservoirs verbindet sich mit dem Heizschlangen und Blasenfallen resultierte in einer 37 ° C Perfusat bis ins Herz reichen.
Teil 2: Harvest der Ratte Herz und Set-up Langendorff Perfusion
- Um tiefe allgemeine Betäubung in 200-250 g Lewis Ratten zu induzieren, ist 100 mg / kg Ketamin und 10 mg / kg Xylazin in die Bauchhöhle injiziert. Zu dieser Mischung, fügen wir 500 U / kg Heparin auf die Blutgerinnung und Myokardischämie während der Explantation Verfahren zu verhindern.
- Für einen einfachen Zugriff auf das Herz und die großen Gefäße, ist die vordere Brustwand entfernt. Danach wird das umliegende Gewebe sorgfältig seziert und die pericardial Sack öffnete.
- Nach der Identifizierung der unteren Hohlvene, ist dieses Schiff mit 5-0 Seide (Ethicon) und das gesamte Herz-Lungen-Block ist explantierten ligiert. Das Gewebe wird sofort in eiskaltem Krebs-Henseleit-Lösung in einem 50 mL Becherglas auf Eis enthielt.
- Die aufsteigende Aorta ist schnell identifiziert und seziert aus dem umgebenden Gewebe. Eine ausreichend große Kanüle (Harvard Apparatus) ist in die Aorta eingeführt, wobei darauf zu achten unterbrechen obligatorischen Perfusion der Koronararterien durch Einsetzen der Kanüle zu weit in die Aortenwurzel. Die Kanüle ist an der aufsteigenden Aorta mit 5-0 Seide (Ethicon) gesichert.
- Die Ratte Herz wird dann auf der Langendorff-Apparatur, ohne dabei Luftblasen in die Kanüle gelegt. Retrograde koronaren vaskulären Perfusion ist nun mit dem warmen, sauerstoffreichen Krebs-Henseleit-Lösung aus der Druck-Kopf in Schritt 1.6 beschrieben aufgebaut.
- Extra-Gewebe, einschließlich der Lunge, ist nun entfernt und das Herz für 20 Minuten perfundiert, um Wiederherstellung der Funktion zu ermöglichen und stabilisieren den Rhythmus. Während dieser Zeit ist eine sehr dünne Thermoelement Temperaturfühler (Cole-Parmer) in die linke Herzkammer Kavität eingebracht und vernäht mit 5-0 Prolene Naht (Ethicon). Die Sonde ist mit einer thermo-Regler (Digi-Sense) angeschlossen, um die Temperatur des Herzens zu gewährleisten ist bei 37 ° C durch eine Anpassung der Einstellungen des Wassers Kreislauf pumpen. Motion von Perfusat tropft von der Herzspitze ist, indem ein Stück Gaze in das Abwasser Behälter minimiert.
Teil 3: Load Herz mit potentiometrischer Farbstoff und erwerben elektrografischen und optische Signale
- Di-8-ANEPPS (Invitrogen) ist in das Herz durch die Umstellung auf die Perfusion Zeile mit dem Krebs-Henseleit gemischt mit dem Fluoreszenzfarbstoff mit einem Hahn geladen. Darüber hinaus ist eine 18G Kanüle in der linken und / oder rechten Vorhof und zusätzlich 50 ml Farbstofflösung gelegt wird langsam in jeder dieser Kammern verabreicht, weil sie nicht ausreichend mit Farbstoff durch die Koronararterien eingeführt perfundiert.
- Während des Ladevorgangs werden 3 EKG-Ableitungen (Harvard Apparatus) sanft auf der Oberfläche des Herzens, die nicht in die Richtung der Optik für die Projektion verwendet gelegt. Electrode N o 1 ist auf der hinteren apikalen Teil des linken Ventrikels, N o 2 auf dem linken Vorhof und N positioniert
- EKG-Verstärker (Hugo Sachs Elektronik) Einstellungen: High Pass Filter: 0,1 Hz
Low Pass Filter: 150 Hz - Die CMOS-Kamera (Redshirt Imaging) und Makroskop positioniert ist mit der XYZ Anpassungen, so dass die Oberfläche des Herzens im Fokus ist und zentriert in der Akquisition Rahmen. Die Kamera und Optik sind auf einer Schwingungsisolierung Tabelle (Minus K Technology), um Resonanzfrequenzen zu minimieren montiert. Zur gleichen Zeit, einen koaxialen Stimulationselektrode (Harvard Apparatus) mit einem isolierten, S48 Elektro-Stimulation Einheit (Grass) kontrolliert wird, ist auf dem rechten Vorhof platziert und das Herz ist Tempo bei 300 Schlägen pro Minute (Abbildung 1).
- Elektrische Stimulation (Grass) Einstellungen:
Rate: 5 Impulse pro Sekunde
Delay: 0,2 ms
Dauer: 2 ms
Volt: 6-12 V
Modus: Wiederholen
Pulse: Single - Für optische Aufnahmen, die Bewegungsartefakte Mangel von Kontraktion, muss das Herz elektromechanisch abgekoppelt werden. Wir tun dies, indem wieder Einschalten Perfusion Zeilen Krebs-Henseleit-Lösung, die 11 mmol / L BDM enthält. Zwischen Akquisitionen, ist das Herz mit unverfälschten Krebs-Henseleit perfundierten zur Erhaltung Lebensfähigkeit der Zubereitung.
- Die Aufnahme-Parameter werden mit Hilfe der Software (Redshirt Imaging) mit folgenden Einstellungen Akquisition:
Konfiguration: 2.000 Hz; 128x128 Pixel-Array
Frame Interval: 0,5 ms
Kamera Amplifier Gain: 5x
On-Chip Gain: 8x-12Me-well
Shutter: 500 ms Verzögerung
Anzahl der Frames: 4000
Dauer: 2000 ms - Alle Zimmer und Ausstattung Lichter ausgeschaltet oder abgeschirmt, um Hintergrundgeräusche während der Aufnahme zu vermeiden. Die LED-Beleuchtung des Herzens nur bei der optischen Aufnahme auf Foto-Bleich-und Farbstoff Toxizität zu verringern. Die Lichtquelle Verschluss ist mit einem 5-V-Impuls über das Control Panel durch ein D-to-A Board in den Rechner (Redshirt Imaging) geliefert gesteuert.
Teil 4: Analysieren Akquisition Informationen über Redshirt Imaging Software
- Nach dem Erwerb werden die Daten verarbeitet mit verschiedenen Filter-Einstellungen. Wir verwenden in der Regel die Standardeinstellungen außer bei der Einstellung der Band Stop / Pass-Filter, der mit der linken Grenze bei 44,0 und den rechten Rand auf 98,0 eingestellt ist. Danach werden die aufgenommenen Informationen verarbeitet und ein Film erzeugt wird (Redshirt Imaging).
- Daten aus einer Akquisition entspricht der lokalen elektrischen Aktivierung bei 16.384 Seiten im Herzen Oberfläche über einen Zeitraum von 2 Sekunden. Die Software ermöglicht es, diese lokalen Signale direkt miteinander und mit der atrialen und ventrikulären elektrografischen Aufnahmen verglichen werden. Die Daten werden dann visualisiert Mapping lokalen elektrischen Aktivierung, um Farbe und Darstellung dieser Informationen als Animation zeigt die raumzeitliche elektrischen Aktivierung der kardialen Oberfläche. Zum Erstellen einer solchen Animation, verwenden wir die Software an:
- zeitlich und / oder räumlich die Daten filtern
- wählen Sie eine Start-und Endzeit für die Animation
- Karte optische Signale in Farbe auf ruhenden Lichtintensität der einzelnen Pixel auf
- Overlay die resultierende Farbe von Daten mit einem Bild des Herzens
- erzeugen die Animation
Teil 5: Repräsentative Ergebnisse
Wenn der perfundierten Herzen Vorbereitung war unbeweglich während der Aufnahme, zeigen die optischen Signale eine gesonderte Spitze für jedes Pixel in einer Veränderung der Emissionsintensität von di-8-ANEPPS beteiligt. Die entsprechenden Filme (Abbildungen 3 und 4) zeigen eine Anregung Wellenfront ausbreitet über die epikardialen Oberfläche des Herzens sowie die gleichzeitig erworbene elektrografischen Aufnahmen (Abbildung 2).
Abbildung 1. Ein Foto von einer Langendorff-perfundierten Herzen Vorbereitung der Darstellung der Positionen der Stimulationselektrode auf den rechten Vorhof und die EKG-Ableitungen, wie in Schritt 3.2 beschrieben.
Abbildung 2. Representative optische Signale und elektrografischen Aufnahmen von einer perfundierten Lewis Ratte Herzen. Panel A zeigt ein Bild der epikardialen Oberfläche für die optische Bildgebung verwendet. Die Position der Pixel ausgewählt, um die Veränderungen in der Fluoreszenz-Emission im Laufe der Zeit in Panel B zeigen, sind durch farbige Pfeile angedeutet. Elektrographische Signale werden in Panel C mit der roten Linie, die atriale Aktivierung und die hellblaue Linie entspricht der ventrikulären Signal angezeigt. Bitteve.com/files/ftp_upload/1138/Figure4.jpg "> Klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild zu sehen.
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Discussion
Die Entfernung des Herzens von narkotisierten Ratten müssen schnell durchgeführt werden, um Myokardischämie zu vermeiden. Wenn Ischämie oder unzureichender Koronarperfusion auftritt, wird das Herz wahrscheinlich entwickeln Arrhythmien und kann sich Infarkt. Darüber hinaus wird diese Herzen zeigen unzureichende Fluoreszenzemission für informative Aufnahmen und anschließende Analysen. Vor dem Einlegen der Farbstoff, müssen Herzmuskelzellen in angemessener Weise mit Krebs-Henseleit-Lösung perfundiert werden zur Schaffung und Aufrechterhaltung einer physiologischen Elektrolytlösung Milieu für die Stabilität von elektrischen Impulsen. Präzise Vorbereitung des Perfusat ist auch notwendig, um eine ordnungsgemäße Orgel Lebensfähigkeit und Funktion aufrecht zu erhalten. Unterschiede in der Elektrolyt-Konzentration oder unzureichende Filterung des Perfusat wird wahrscheinlich zu tödlichen Myokardinfarkt Dysfunktion und Herz-Rhythmus-Störungen führen. Für die optische Aufnahmen, muss das Herz komplett mit Spannung Farbstoff geladen werden. Dies ist besonders wichtig für die Myokard wie diese Kammern nicht durch die Koronararterien gut durchblutet. Wir haben festgestellt, dass zusätzliche intra-kavitäre Perfusion der Vorhöfe wird ein gutes optisches Signal zu etablieren. Darüber hinaus erfordert Erwerb von hochwertigen Spannungs-Kurven der perfundierten Herzen zu unbeweglich, sonst ändert sich in Fluoreszenzemission nicht zuverlässig eingesetzt werden, um Veränderungen in Membranpotential mit hoher Wiedergabetreue durch Artefakte, die durch Drift verursacht zu verfolgen. Dies wird in mehreren Peaks für ein Pixel als ein einzelner Peak führen. Andere Methoden, um Bewegungsartefakte aus optischen Aufnahmen zu beseitigen sind mechanische Ruhigstellung, Behandlung mit anderen Erregung und Kontraktion Entkuppler (zB Cytochalasin D, blebbistatin), Signalverarbeitung und durch mathematische Modellierung [1, 8]. Schließlich das hier beschriebene Verfahren stellt lediglich Informationen über Aktionspotential Bewegung auf die kardiale epikardialen Oberfläche. Alternative Gewebe Vorbereitungen und Infrarot potentiometrische Farbstoffe können zu lösen die elektrische Ausbreitungseigenschaften in anderen Regionen des Herzens.
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Disclosures
Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her durch die Institutional Animal Care und Verwenden Ausschusses im Kinderkrankenhaus Boston gesetzt durchgeführt.
Acknowledgments
Und Beiträge an die Reizleitung Fund an der Kinderklinik Boston; Diese Arbeit wird durch Forschungsmittel von den National Institutes of Health (HL088206 HL068915) unterstützt.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| CardioCMOS-SM128f | Equipment | RedShirtImaging, LLC | ||
| CardioPlex Software | Equipment | RedShirtImaging, LLC | ||
| LUXEON LED Light Source 460-490 nm | Equipment | Lumileds Lighting, US, LLC, San Jose, CA 95131 USA | LXHL-PB02 | |
| ECG Amplifier Type 689 Hugo Sachs Elektronik | Equipment | Harvard Apparatus | 730149 | |
| Dichroic Mirror 505 nm | Equipment | Semrock | FF505-SDi01-25x36 | |
| Emission Filter 605 nm Long Pass | Equipment | SciMedia | ||
| THT Sideways | Equipment | SciMedia | 25 BM-8 | |
| Mini Ball Joint Holder | Equipment | Harvard Apparatus | BS4 73-0177 | |
| Small Stimulation Electrode Set | Equipment | Harvard Apparatus | BS4 73-0160 | |
| BM-6 Benchtop Vibration Isolation Platform | Equipment | Technology Inc., Inglewood, CA 90301 | 25 BM-6 | |
| Monopolar ECG Electrode | Equipment | Harvard Apparatus | BS4 73-0200 | |
| Roller Pump SCI 400 | Equipment | Watson-Marlow Pumps Group | 401U/D1 | |
| Roller Pump MasterFlex Easy Load II | Equipment | Cole-Parmer | Model 77201-60 | |
| Tubing Marprene #14 | Equipment | Watson-Marlow Pumps Group | 902.0016.016 | |
| MasterFlex Tubing | Equipment | PharMed, Westlake, OH 44145 USA | 06485-25 | |
| S48 Square Pulse Stimulator | Equipment | Grass Technologies | Model S48 | |
| SIU5 RF TRANSFORMER ISOLATION UNIT | Equipment | Grass Technologies | Model SIU5 | |
| 5 Liter Water Jacketed Reservoir | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 120142-5 | |
| 2 Liter Water Jacketed Reservoir | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 120142-2 | |
| 0.5 Liter Water Jacketed Reservoir | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 120142-0 | |
| 0.25 Liter Water Jacketed Reservoir | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 120142-025 | |
| 10 ml Heating Coil | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 158822 | |
| Compliance Bubble Trap | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 130149 | |
| Luer Disconnect Cannula | Equipment | Harvard Apparatus | 72-1444 | |
| 3-Way stopcock, FLL to MLT, No Port Covers | Equipment | Harvard Apparatus | BS4 72-2630 | |
| Thermocouple Thermometer | Equipment | Cole-Parmer | WU-91100-40 | |
| Ultra Fine IT-Series Flexible Microprobe | Equipment | PhysiTemp Instruments Inc., Clifton, NJ 07013 USA | IT-24P | |
| Oscilloscope Tektronix TDS 1002 | Equipment | Tektronix, Inc. | TDS 1002B | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Reagent | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| Ketamine HCl | Reagent | Hospira Inc. | RL-0065 | |
| Xylazine | Reagent | Lloyd, Inc. | LB15705A | |
| E-TOXA-CLEAN® | Reagent | Sigma-Aldrich | E9029 | |
| Di-8-ANEPPS | Reagent | Invitrogen | D-3167 |
References
- Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G.
- Hucker, W. J. Images in cardiovascular medicine. Optical mapping of the human atrioventricular junction. Circulation. 117 (11), 1474-147 (2008).
- Entcheva, E., Bien, H. Macroscopic optical mapping of excitation in cardiac cell networks with ultra-high spatiotemporal resolution. Prog Biophys Mol Biol. 92 (2), 232-257 (2006).
- Entcheva, E. Fluorescence imaging of electrical activity in cardiac cells using an all-solid-state system. IEEE Trans Biomed Eng. 51 (2), 333-341 (2004).
- Stamm, C. Rapid endotoxin-induced alterations in myocardial calcium handling: obligatory role of cardiac TNF-alpha. Anesthesiology. 95 (6), 1396-1405 (2001).
- Choi, Y. H. Cardiac conduction through engineered tissue. Am J Pathol. 169 (1), 72-85 (2006).
- Skrzypiec-Spring, M. Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium. J Pharmacol Toxicol Methods. 55 (2), 113-126 (2007).
- Fedorov, V. V. Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts. Heart Rhythm. 4 (5), 619-626 (2007).
