Summary
चेचक संक्रमण और कोशिकाओं मेजबान और वायरल जीन की अभिव्यक्ति के HeLa के विश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल. 3 के भाग 2.
Abstract
परिवार
Protocol
भाग 1: शाही सेना से सीडीएनए संश्लेषण
- Ambion एमिनो एलिल MessageAmp द्वितीय किट का उपयोग करने से पहले, धोने बफ़र्स के लिए की सिफारिश की मात्रा 100% इथेनॉल जोड़ें.
- पीसीआर प्रतिक्रिया ट्यूब में 100ng बीच T7 oligo प्राइमर (डीटी) के कुल शाही सेना और 1μl 5μg जोड़ें. मात्रा लाओ 12μl nuclease मुक्त पानी के साथ करने के लिए.
- में 70 नमूने सेते ° सी thermocycler में 10 मिनट के लिए.
- 70 से संक्षिप्त डिग्री सेल्सियस अपकेंद्रित्र और शाही सेना के नमूने निकालें. बर्फ पर रखें.
- 1 सेंट Strand संश्लेषण मास्टर मिश्रण तैयार है और कमरे के तापमान पर रखने (त्रुटि pipetting के लिए 10% व्यय के साथ). (तालिका 1)
- विंदुक मास्टर मिक्स या झटका धीरे मिश्रण करने के लिए और फिर संक्षिप्त अपकेंद्रित्र.
- प्रत्येक आरएनए नमूने के मास्टर मिक्स के 8μl स्थानांतरण. ऊपर और नीचे pipetting 3-4 बार मिक्स.
- Thermocycler में 2 घंटे के लिए 42 ° सी में सेते हैं.
- अपकेंद्रित्र नमूने और बर्फ पर संक्षेप में जगह. तुरंत dsDNA संश्लेषण के अगले कदम के लिए आगे बढ़ना.
- 2 एन डी बर्फ पर Strand संश्लेषण मास्टर मिश्रण (त्रुटि pipetting के लिए 10% व्यय के साथ) (तालिका 2 ). तैयार
- विंदुक मास्टर मिक्स या झटका धीरे मिश्रण करने के लिए और फिर संक्षिप्त अपकेंद्रित्र.
- प्रत्येक नमूने के 80μl स्थानांतरण और धीरे से ऊपर और नीचे pipetting 3-4 बार मिश्रण.
- Thermocycler में 2 घंटे के लिए 16 ° C पर सेते हैं.
- 2 घंटे ऊष्मायन के बाद, सीडीएनए साफ - अप कदम के साथ आगे बढ़ना या -20 डिग्री सेल्सियस पर तुरंत फ्रीज
भाग 2: डबल असहाय सीडीएनए साफ - अप
- फ्रिज से शुद्ध सीडीएनए निकालें और यह प्रयोग करने से पहले 30 मिनट के लिए कमरे Temp को संतुलित करने के लिए अनुमति देते हैं. बोतल शेक करने के लिए पूरी तरह से उपयोग करने से पहले चुंबकीय सीडीएनए बाध्यकारी मोती resuspend.
- विभाज्य 1.5mL ट्यूब और डिग्री सेल्सियस पिछले 2hr ऊष्मायन के दौरान कम से कम 10 मिनट के लिए 50-60 पर सेते में nuclease मुक्त पानी.
- प्रत्येक नमूने के सीडीएनए शुद्ध के 180μl जोड़ें, और अच्छी तरह से ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिश्रण. एक 96 अच्छी तरह से थाली दौर नीचे नमूने स्थानांतरण.
- धीरे एक कक्षीय हिलनेवाला पर कम से कम 2 मिनट के लिए थाली झटकों से नमूने मिश्रण करने के लिए जारी रखें.
- एक चुंबकीय खड़ा करने के लिए थाली ले जाएँ चुंबकीय मोतियों पर कब्जा. लगभग 6 मिनट के लिए स्टैंड पर थाली छोड़ दो, या जब तक मिश्रण पारदर्शी हो जाता है और बाध्यकारी मोती pelleted है.
- ध्यान से एक वैक्यूम Aspirator के साथ चुंबकीय मोतियों को परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला aspirate. वैकल्पिक रूप से, ध्यान से एक विंदुक के साथ सतह पर तैरनेवाला हटायें और सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
- चुंबकीय स्टेंड से थाली निकालें.
- प्रत्येक अच्छी तरह 150μl सीडीएनए धो बफर जोड़ें और कक्षीय हिलनेवाला पर मध्यम गति से 1 मिनट के लिए थाली हिला. मोती इस कदम पर नहीं फैलाने, धोने बफर के कम सतह तनाव के कारण होगा.
- एक चुंबकीय खड़ा करने के लिए थाली ले जाएँ चुंबकीय मोतियों पर कब्जा.
- ध्यान से एक वैक्यूम Aspirator के साथ चुंबकीय मोतियों को परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला aspirate. वैकल्पिक रूप से, ध्यान से एक विंदुक के साथ सतह पर तैरनेवाला हटायें और सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
- चुंबकीय स्टेंड से थाली निकालें.
- धोने 150μl सीडीएनए धो बफर के साथ एक 2 एन डी समय दोहराएँ.
- 2 एन डी धोने के बाद, कक्षीय हिलनेवाला पर 2 मिनट के लिए अधिकतम गति पर थाली झटकों से मोती सूखी . Overdry नहीं करो!
- मोतियों से प्रत्येक नमूने के लिए preheated nuclease मुक्त पानी के 18μl जोड़कर सीडीएनए Elute.
- सख्ती से हिला कक्षीय हिलनेवाला पर 3 मिनट के लिए थाली, तो जांच के लिए यकीन है कि चुंबकीय मोतियों को पूरी तरह बिखरे हैं. यदि नहीं, मिलाते जारी है.
- एक बार चुंबकीय मोतियों को पूरी तरह छितरी हुई है, एक चुंबकीय खड़ा करने के लिए थाली को स्थानांतरित करने के लिए चुंबकीय मोतियों पर कब्जा.
- ध्यान से एक नया पीसीआर प्लेट (या पीसीआर ट्यूबों) eluted सीडीएनए हस्तांतरण (16μl ~).
- अगले कदम के लिए सीधे आगे बढ़ें, या -20 डिग्री सेल्सियस पर सीडीएनए फ्रीज
इन विट्रो प्रतिलेखन में (IVT): भाग 3
- कमरे के तापमान पर IVT मास्टर मिश्रण (3 टेबल). तैयार
- धीरे मास्टर मिक्स या मिश्रण करने के लिए झटका विंदुक, और संक्षेप में अपकेंद्रित्र.
- प्रत्येक नमूने के 24μl जोड़ें, और धीरे से ऊपर और नीचे pipetting 3-4 बार मिश्रण.
- Thermocycler में 14 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं, तो 4 डिग्री सेल्सियस तक अगले कदम के लिए तैयार पकड़ो.
भाग 4: ARNA साफ IVT के बाद
- भंवर शाही सेना बाध्यकारी मोती संक्षेप में उपयोग करने से पहले एक भी मिश्रण प्राप्त करने के लिए.
- कमरे के तापमान पर ARNA बंधन मिक्स तैयार (तालिका 4) यह समय से आगे किया जा सकता है. तैयार बाध्यकारी मिश्रण कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है एक सप्ताह के लिए.
- Vortexing द्वारा अच्छी तरह मिक्स.
- विभाज्य 1.5mL ट्यूब और 50-60 ° सी में कम से कम 10 मिनट के लिए सेते में ARNA Elution बफर.
- ARNA बाध्यकारी मिश्रण के 70μl जोड़ेंप्रत्येक नमूना के लिए और ऊपर और नीचे pipetting 3-4 बार अच्छी तरह से मिश्रण.
- पीसीआर थाली से एक 96 अच्छी तरह से थाली दौर नीचे नमूने स्थानांतरण.
- 50μl 100% प्रत्येक नमूना के लिए isopropanol जोड़ें और ऊपर और नीचे pipetting 3-4 बार अच्छी तरह से मिश्रण.
- धीरे कम से कम 2 मिनट के लिए एक कक्षीय हिलनेवाला पर थाली मिलाने के लिए अच्छी तरह से नमूने मिश्रण.
- एक चुंबकीय खड़ा करने के लिए थाली ले जाएँ चुंबकीय मोतियों पर कब्जा. स्टैंड पर थाली छोड़ दो जब तक मिश्रण पारदर्शी हो जाता है और बाध्यकारी मोती pelleted है.
- ध्यान से एक वैक्यूम Aspirator के साथ चुंबकीय मोतियों को परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला aspirate. वैकल्पिक रूप से, ध्यान से एक विंदुक के साथ सतह पर तैरनेवाला हटायें और सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
- चुंबकीय स्टेंड से थाली निकालें.
- प्रत्येक अच्छी तरह 100μl ARNA धो समाधान जोड़ें और कक्षीय हिलनेवाला पर मध्यम गति से 1 मिनट के लिए थाली हिला. मोती पूरी तरह से इस कदम पर नहीं फैलाने सकता है.
- एक चुंबकीय खड़ा करने के लिए थाली ले जाएँ चुंबकीय मोतियों पर कब्जा.
- ध्यान से एक वैक्यूम Aspirator के साथ चुंबकीय मोतियों को परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला aspirate. वैकल्पिक रूप से, ध्यान से एक विंदुक के साथ सतह पर तैरनेवाला हटायें और सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
- चुंबकीय स्टेंड से थाली निकालें.
- धोने 100μl ARNA धो समाधान के साथ एक 2 एन डी समय दोहराएँ.
- 2 एन डी धोने के बाद, कक्षीय हिलनेवाला पर 1 मिनट के लिए अधिकतम गति पर थाली झटकों से मोती सूखी . नमूने overdry मत करो!
- मोतियों से प्रत्येक नमूने के 40μl preheated ARNA Elution बफर जोड़कर ARNA Elute.
- सख्ती से हिला कक्षीय हिलनेवाला पर 3 मिनट के लिए थाली, तो जांच के लिए यकीन है कि चुंबकीय मोतियों को पूरी तरह बिखरे हैं. यदि नहीं, मिलाते जारी है.
- एक बार चुंबकीय मोतियों को पूरी तरह छितरी हुई है, एक चुंबकीय खड़ा करने के लिए थाली को स्थानांतरित करने के लिए चुंबकीय मोतियों पर कब्जा. सतह पर तैरनेवाला एमिनो एलिल साफ अप शामिल ARNA शामिल हैं.
- ध्यान से एक नया पीसीआर प्लेट (या पीसीआर ट्यूबों) eluted ARNA हस्तांतरण.
- (वैकल्पिक कदम) NanoDrop स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर 1.5μl को मापने के द्वारा नमूनों की शाही सेना एकाग्रता की जाँच करें.
- अगले कदम पर तुरंत जारी रखने के लिए, या -80 पर ARNA दुकान डिग्री सेल्सियस
तालिका 1: सीडीएनए 1 सेंट Strand संश्लेषण मास्टर मिक्स
| अभिकर्मक | 1 प्रतिक्रिया के लिए राशि |
| 10X पहले Strand बफर | 2 μl |
| dNTP मिक्स | 4 μl |
| Ribonuclease अवरोध करनेवाला | 1 μl |
| ऐरे स्क्रिप्ट | 1 μl |
तालिका 2: सीडीएनए 2 एन डी Strand संश्लेषण मास्टर मिक्स
| अभिकर्मक | 1 प्रतिक्रिया के लिए राशि |
| Nuclease मुफ्त पानी | 63 μl |
| 10X दूसरा Strand बफर | 10 μl |
| dNTP मिक्स | 4 μl |
| डीएनए पोलीमरेज़ | 2 μl |
| RNase एच | 1 μl |
तालिका 3: IVT मास्टर मिक्स
| अभिकर्मक | 1 प्रतिक्रिया के लिए राशि |
| aaUTP समाधान (75 मिमी) | 2 μl |
| एटीपी, CTP, GTP मिश्रण (25 मिमी) | 12 μl |
| T7 UTP समाधान (75 मिमी) | 2 μl |
| T7 10X रिएक्शन बफर | 4 μl |
| T7 एनजाइम मिक्स | 4 μl |
टेबल 4: ARNA बंधन मिक्स
| अभिकर्मक | 1 प्रतिक्रिया के लिए राशि |
| शाही सेना के बंधन * मोती | 10 μl |
| मनका Resuspension समाधान * | 4 μl |
| 100% isopropanol ** | 6 μl |
| ARNA बंधन बफर ध्यान लगाओ | 50 μl |
* मनका resuspension समाधान के साथ शाही सेना बाध्यकारी मोती पहली बार मिक्स.
** Isopropanol जोड़ें और ARNA बाध्यकारी बफर ध्यान केंद्रित जोड़ने से पहले अच्छी तरह से मिश्रण.
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Discussion
गंभीर कदम
प्रवर्धन के एक दूसरे दौर सरणी डेटा में biases के रूप में देखा गया है की सलाह नहीं दी है. प्रत्येक enzymatic कदम (1 सेंट और 2 एन डी कतरा सीडीएनए संश्लेषण, IVT) पर ध्यान मिश्रण अच्छा प्रवर्धन पैदावार प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है, के रूप में उचित तापमान पर प्रत्येक enzymatic कदम के ऊष्मायन है. समायोज्य गर्म ढक्कन के साथ एक पीसीआर cycler पसंदीदा है - भी विचलन के रूप में IVT के दौरान एक हवाई संकरण ओवन या पानी के स्नान संकरण में 2-3 डिग्री के रूप में छोटे काफी प्रवर्धित उत्पाद की उपज को प्रभावित कर सकते हैं.
/ आवेदन महत्व
लेबल इस प्रोटोकॉल से परिणामस्वरूप आरएनए मानव, वायरल, या कस्टम प्रोटीन संकरित संस्कृति में संक्रमित कोशिकाओं के जीन की अभिव्यक्ति प्रतिक्रियाओं का आकलन किया जा सकता है. माइक्रोएरे प्लेटफार्मों भिन्न है, तो लेबल जांच से संकरण मिश्रण की तैयारी के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें.
एक कस्टम डिजाइन poxvirus एक सरणी का उपयोग करना, हम सामान्य श्रेणियों में "जल्दी" या "देर" संकरण संकेत के समय पर आधारित है और चाहे या नहीं वायरल डीएनए प्रतिकृति प्रतिलेख पता लगाने के लिए आवश्यक किया गया था जीन वर्गीकृत कर रहे थे. हम प्रत्येक अस्थायी कक्षा में जीन की उम्मीद कार्यात्मक श्रेणियों (यानी, जल्दी, मध्यवर्ती और देर जीन की उम्मीद) प्रतिलेखन के सही समय के रूप में परिवर्तन मनाया.
इस काम में उपयोग तरीकों वायरस प्रतिकृति चक्र में जल्दी या देर लिखित जीन की भविष्यवाणी करने में सक्षम हैं, लेकिन एक जल्दी और देर प्रमोटर के साथ एक दोहरी / जल्दी देर प्रमोटर के साथ टेप के बाद जीन बनाम अधिक कठिनाई भेद केवल प्रारंभिक जारी रहती है और हो सकता है देर से समय पर पाया. इसके अलावा, देर वायरल जीनों के ट्रांसक्रिप्शन के माध्यम से चलाने के एक दिया / सरणी पर जांच मौके पर संकेत को प्रभावित है, सरणी के लिए hybridizing शाही सेना के रूप में नामित ओआरएफ या एक अपस्ट्रीम ओआरएफ से आया हो सकता है है हो सकता है. खपरैल का छत arrays के लिए इस समस्या को हल करने का प्रयास किया है, लेकिन चुनौतियों संकरण आधारित 2,3,4 दृष्टिकोण का उपयोग प्रतिलेखन के माध्यम से चलाने के पता लगाने में रहते हैं.
होस्ट transcriptional पैटर्न भी इन तरीकों का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है. हालांकि, चेचक तंत्र की एक किस्म encodes के लिए मेजबान प्रतिक्रियाओं रोकना, और मेजबान transcriptional प्रतिक्रियाओं अन्य 5,6,7,8 stimuli करने के लिए तुलना में कम हो सकता है . कई मेजबान बचाव में शामिल जीनों की अभिव्यक्ति के बाद संक्रमण के बाद बदल दिया है, इसलिए वायरल जीन है कि मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्रतिक्रिया के योगदान को ध्यान में लिया जाना चाहिए.
इन तरीकों का उपयोग, सभी वायरल जीनों के transcriptional समय का एक नक्शा और पहचान किया जा सकता है अज्ञात वायरल जीनों के कार्यों को पूछताछ के लिए इस्तेमाल किया. इसके अलावा, इन तरीकों वायरस और मेजबान के बीच जटिल वार्ता टुकड़े करना करने के लिए उपयोग किया जा सकता है. इन विधियों अन्य मेजबान रोगज़नक़ संक्रमण सिस्टम को मोटे तौर पर लागू होते हैं. यदि ब्याज की रोगज़नक़ mRNAs polyadenylated नहीं करता है, वैकल्पिक तरीकों को सीधे कुल शाही सेना लेबल किया जा सकता है रैखिक प्रवर्धन के बिना. दोनों मेजबान और तुल्यकालिक संक्रमण के दौरान वायरस जीन की अभिव्यक्ति का विश्लेषण करके, इन तरीकों हमें मेजबान सेलुलर के रूप में अच्छी तरह के रूप में वायरस के संक्रमण के खिलाफ मेजबान वातावरण काउंटर गढ़ के साथ वायरस बातचीत में अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए अनुमति देते हैं.
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Acknowledgments
व्हाइटहेड संस्थान अध्येता फंड
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Amino Allyl MessageAmp II aRNA amplification kit | Reagent | Applied Biosystems | AM1753 | For 20 reactions |
| Amino Allyl MessageAmp II aRNA amplification kit | Reagent | Applied Biosystems | AM1821 | For 100 reactions, in a 96-well format |
| NanoDrop ND-1000 UV-VIS spectrophotometer | Other | NanoDrop | ND-1000 | Or equivalent spectrophotometer |
References
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