Zebravis hersenventrikel Injection

Summary

Na de vorming van neurale buis, de neuroepithelium vernauwt en plooien, terwijl de buis gevuld met embryonale cerebrospinale vloeistof (eCSF) om de embryonale hersenen ventrikels vormen. We hebben deze ventrikel injectie techniek om beter te visualiseren van de vloeistof gevulde ruimte in tegenstelling tot de neuro-vorm in een live-embryo.

Abstract

Juiste hersenventrikel vorming tijdens de embryonale ontwikkeling van de hersenen nodig is voor een normale hersenfunctie. Brain ventrikels zijn de zeer geconserveerd holtes in de hersenen die zijn gevuld met hersenvocht. In de zebravis, na de vorming neurale buis, de neuroepithelium ondergaat een reeks van vernauwingen en plooien, terwijl het zich vult met vocht wat resulteert in hersenventrikel formatie. Om het proces van het ventrikel en de vorming van neuro-epitheliale vorm van veranderingen die zich voordoen op hetzelfde moment te begrijpen, moesten we een manier om de ventrikel ruimte te visualiseren in vergelijking met het hersenweefsel. Echter, de aard van de transparante zebravis embryo's maakt het moeilijk om het weefsel te onderscheiden van de hartkamer ruimte. Daarom ontwikkelden we een hersenventrikel injectie techniek waarbij het ventrikel ruimte is gevuld met een fluorescerende kleurstof en afgebeeld door helderveld en fluorescentie microscopie. De helderveld en de fluorescerende beelden worden vervolgens verwerkt en bovenop in Photoshop. Deze techniek zorgt voor visualisatie van de ventrikel ruimte met de fluorescerende kleurstof, in vergelijking met de vorm van de neuroepithelium in de helderveld beeld. Hersenventrikel injectie in de zebravis kan worden toegepast vanaf 18 uur na de bevruchting tot begin larvale stadia. We hebben gebruik gemaakt van deze techniek op grote schaal in onze studie van de hersenen ventrikel vorming en morfogenese evenals in het karakteriseren van de hersenen morfogenese mutanten (1-3).

Protocol

Protocol

Deel 1: Voorbereiding voor micro-injectie

1. Bereid u voor op de injectie door te trekken met behulp van capillaire naalden Sutter Instruments naald trekker.
2. Vul de naald met een fluorescerende kleurstof (zoals Texas-Rood Dextran).
3. Monteer de naald in een micromanipulator en microinjectie apparatuur.
4. Snijd de naald op de juiste grootte in een hoek aan een afgeschuinde tip te creëren.
5. Meet de druppelgrootte en controleer of het is tussen de 1-2NL per injectie in de olie.

Deel 2: Het voorbereiden van de embryo's

1. Injecteer de embryo's 30 minuten eerder dan het stadium van belang. Bijvoorbeeld, om de hartkamers studie bij 24 uur na de bevruchting (HPF), injecteer de embryo's op 23,5 hpf. Stadium de embryo's op basis van Kimmel et al.. (4).
2. Onder de stereomicroscoop, verwijder voorzichtig de chorion uit de embryo's met behulp van pincet.
3. Met behulp van een plastic schaaltje bekleed met 1% agarose, prik gaatjes in de agarose met een kunststof 100-200 ul pipetpunt. Verwijder voorzichtig het agarose pluggen uit de gaten met behulp van pincet.
4. Overdracht van de embryo's embryo media in de agarose schotel met gaten.
5. Voeg tricaïne (gemaakt volgens Westerfield (5)) aan de media om de embryo's verdoven en het voorkomen van beweging tijdens het experiment.
6. Plaats voorzichtig het embryo staart beneden in het gat, en oriënteer het zo dat de injectie toestel is aan de achterzijde van het embryo.

Deel 3: Het injecteren van de hersenen ventrikel

1. Te injecteren in de hersenen ventrikel, regelen van de micromanipulatie setup, zodat de top van de naald in hetzelfde gezichtsveld als het embryo op hoog vermogen.
2. Voorzichtig zet de naald door de dunne roofplate van de achterhersenen juist achter het r0/r1 hingepoint zonder het raken van de hersenweefsel hieronder.
3. Voldoende om alleen maar te injecteren kleurstof volledig te vullen de hartkamers. Het kan enkele injecties om het ventrikel ruimte op te vullen, afhankelijk van het stadium van het embryo.

Deel 4: Imaging

1. Met behulp van een schone 1% agarose-gecoate schaal, poke nieuwe gaten in de schaal, verwijder de stekkers, en voeg tricaïne aan de embryo's verdoven en beweging te voorkomen.
2. Plaats de staart van de ventrikel-geïnjecteerde embryo in het gat en de positie voor een dorsale beeld.
3. Neem een ​​afbeelding met behulp van doorvallend licht.
4. Het is zeer cruciaal voor NIET BEWEGEN het embryo of de microscoop.
5. Wijzig de instellingen op de microscoop en maak een beeld met TL-licht.
6. Verplaats het embryo laterale opnamen te maken met zowel doorvallend licht en tl-licht.
7. Sla de afbeeldingen als TIFF-bestanden voor beeldverwerking in Photoshop.

Deel 5: Image Processing

1. Voor het verwerken van de beelden in Photoshop, opent u het doorgelaten licht en tl-licht foto's van dezelfde embryo die in dezelfde positie. Zorg ervoor dat alle instellingen zijn hetzelfde voor elk beeld.
2. Sleep uw fluorescerende beeld op het doorgelaten licht beeld en lijn ze precies.
3. Met de fluorescerende afbeelding geselecteerd, selecteert u "Image", "Aanpassingen," en dan "Kleur vervangen" en verander de zwarte achtergrond op wit.
4. In de "Kleur vervangen" venster aan te passen de "vaagheid"-factor naar rechts tot de tl-beelden ziet er gelijk van kleur zijn.
5. In de "Layers" venster, selecteer "Multiply" om de overlay beelden te bekijken. Uw ventrikel ruimte beeld moet overeenkomen met het doorgelaten licht afbeelding precies.
6. Sla dit bestand op en herhaal dit voor alle andere afbeeldingen.

Vertegenwoordiger Resultaten / Resultaat

Juiste hartkamer injectie afbeeldingen worden weergegeven in figuur 1 panelen AD, terwijl een voorbeeld van de verkeerde injectie beelden worden getoond in de EH. De juiste injecties hebben scherpe randen en niet-diffuse kleurstof. Verkeerde injectie, die optreedt wanneer de naald is te ver ingevoegd in het ventrikel en raakt het hersenweefsel hieronder, kan resulteren in een kleurstof die zichtbaar buiten de ventrikel ruimte en in de dooier.

Figuur 1. Ventrikel injecties van 25 HPF wild type embryo's. (AD) Correcte injectie methode en (EH) een verkeerde injectie methode die als voorbeelden. (A, E) Dorsale helderveld beelden met bijbehorende fluorescerende beelden (B, F) en de overlay van de TL-en helderveld beelden (C, G) voor zowel de juiste en onjuiste getoond injectie methoden. Pijlen geven de regio's waar de kleurstof is verder gegaan dan de hersenen ventrikel ruimte te wijten aan een verkeerde ventrikel injectie (zie "Problemen oplossen"). Anterior is aan de linkerkant in alle afbeeldingen.

Problemen oplossen:

Probleem Veroorzaken	Remedie
U bent kneuzingen het embryo met de naald.	Uw naald is te bot of de tip is te groot.	Begin met een nieuwe naald en breken niet zo ver terug. Bevel je naald om het scherp te maken als een injectienaald.
De kleurstof is in de embryo en de dooier (zie figuur 1E-H).	Uw naald ging door het weefsel en niet blijven in het ventrikel ruimte.	De naald kan niet genoeg scherp zijn, dus je bent niet in staat om de snelheid van het lek te controleren.
De kleurstof is te zwak of niet in de voorhersenen.	Je hebt geen gebruik maken van een hoog genoeg druk voor de injectie, of je naald was niet ver genoeg juist voor de voorhersenen bereiken wanneer u geïnjecteerd de kleurstof.	Verhoog uw inspuitdruk of plaats je naald iets meer anterior tijdens de injectie. Je kunt de naald door de middenhersenen-achterhersenen grens als er meer detail nodig is in de voorhersenen. U kunt ook gewoon wachten op een beetje voor de kleurstof verder te verspreiden voor de beeldvorming.
Uw fluorescerende beelden zijn donker rond de randen na de kleur vervanging in Photoshop.	U bent vergeten de "vaagheid" te wijzigen in de kleur te vervangen venster.	Verplaats de "vaagheid" helemaal naar rechts in de kleur te vervangen venster.
De naald zal niet doorboren de achterhersenen roofplate.	Uw naald is niet goed afgesneden.	Maak een nieuwe naald. Als je doet heel veel injecties die u nodig heeft meerdere naalden als ze kunnen krijgen saai.

Discussion

In deze video laten we zien hoe de fluorescente kleurstof (Texas-Rood Dextran) te injecteren in de ontwikkeling van de hersenen zebravis ventrikels. Deze methode wordt gebruikt om de hersenen ventrikel ruimte in tegenstelling tot de omringende neuroepithelium te visualiseren en is uiterst nuttig voor het bepalen van de vorm van de hartkamer ruimte en de vorm van het omliggende hersenweefsel. Het stelt ons in staat beter te begrijpen van het proces van de hersenen ventrikel vorming en de hersenen morfogenese loop van de tijd in de live embryo. Deze techniek is een uitstekend hulpmiddel voor het bestuderen van de hersenen ventrikel vorming van gebreken en voor de initiële karakterisering en studie van de hersenen morfogenese mutanten.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Forceps	Tool	Fine Science Tools	11252-20
Capillary Tubes (needles)	Tools	Frederick Haer and Co.	30-30-1
Agarose-Coated dishes	Tools	Agarose (Seakem GTG; Lonza) Dishes (Corning)	Agarose (50027) Dishes (430166)	Make agarose approximately 2-3 mm deep in the dish depending on the stage of embryo you are injecting
Dissecting Microscope	Microscope	Carl Zeiss, Inc.
Microscope Camera with Fluorescence capabilities and with image capture software	Tools
1-200 μ pipette tips	Tools	USA Scientific, Inc.	1111-0806	These are the perfect size to poke the holes in the agarose and have the embryos fit perfectly.
Photoshop	Image Analysis	Adobe
Embryo Loop	Tools			Make these yourself with a glass pipette and hair or fishing line and seal with beeswax.
Microinjector	Tools	Harvard Apparatus	PL1-100
Needle Puller	Tools	Sutter Instrument Co.		Settings (Heat 785, Pull 70, Velocity 40, Time 70).
Micromanipulator	Tools	Narishige International
Fluorescent dye Texas-Red Dextran 70,000MW	Reagent	Molecular Probes, Life Technologies	D1830	Other Molecular weights are available if desired.
Tricaine (3-aminobenzoic acid ethyl ester)	Reagent	Sigma-Aldrich	A-5040
Embryo Media	Reagent			According to Westerfield (5)