Summary
Dopo la formazione del tubo neurale, il neuroepitelio restringe e le pieghe mentre il tubo si riempie di liquido cerebrospinale embrionale (eCSF) per formare i ventricoli del cervello embrionale. Abbiamo sviluppato questa tecnica ventricolo iniezione per visualizzare meglio lo spazio pieno di liquido in contrasto con la forma neuroepiteliale in un embrione vivo.
Abstract
Corretta formazione ventricolo del cervello durante lo sviluppo embrionale del cervello è necessario per normali funzioni cerebrali. Ventricoli cerebrali sono cavità altamente conservati all'interno del cervello che sono pieni di liquido cerebrospinale. In zebrafish, dopo la formazione del tubo neurale, il neuroepitelio subisce una serie di costrizioni e pieghe mentre si riempie di liquido con conseguente formazione del cervello ventricolo. Al fine di comprendere il processo di formazione del ventricolo, e la forma cambia neuroepiteliale che si verificano allo stesso tempo, abbiamo bisogno di un modo per visualizzare la space ventricolo rispetto al tessuto cerebrale. Tuttavia, la natura di embrioni di zebrafish trasparente rende difficile distinguere il tessuto dallo spazio ventricolo. Pertanto, abbiamo sviluppato una tecnica di ventricolo cerebrale iniezione dove viene riempito lo spazio ventricolo con un colorante fluorescente e ripreso dal campo chiaro e microscopia a fluorescenza. Il campo chiaro e le immagini fluorescenti vengono poi elaborati e sovrapposti in Photoshop. Questa tecnica permette per la visualizzazione dello spazio ventricolo con il colorante fluorescente, rispetto alla forma del neuroepitelio nell'immagine campo chiaro. Ventricolo iniezione cervello in zebrafish può essere impiegato da 18 ore dopo la fecondazione ai primi stadi larvali. Abbiamo usato questa tecnica ampiamente nei nostri studi di formazione del cervello del ventricolo e la morfogenesi e nella caratterizzazione di mutanti morfogenesi del cervello (1-3).
Protocol
Protocollo
Parte 1: Preparazione per la microiniezione
- Preparare l'iniezione tirando aghi capillare utilizzando Sutter estrattore ago Instruments.
- Riempire l'ago con un colorante fluorescente (come il Texas-Red destrano).
- Montare l'ago in un apparato micromanipolatore e microiniezione.
- Tagliare l'ago per la dimensione appropriata in un angolo per creare una punta smussata.
- Misurare la dimensione delle gocce e controllare che sia tra 1-2NL per iniezione d'olio.
Parte 2: Preparazione degli embrioni
- Iniettare gli embrioni 30 minuti prima rispetto alla fase di interesse. Ad esempio, per studiare i ventricoli a 24 ore dopo la fecondazione (HPF), iniettare gli embrioni a 23,5 HPF. Fase gli embrioni secondo Kimmel et al. (4).
- Con lo stereomicroscopio, rimuovere con attenzione il corion dagli embrioni utilizzando pinze.
- Utilizzando un piatto di plastica rivestito con 1% di agarosio, fare buchi nella agarosio con un puntale di plastica 100-200 microlitri. Rimuovere con cautela i tappi di agarosio dai fori con pinze.
- Trasferimento degli embrioni nei media embrione nel piatto agarosio con fori.
- Aggiungi tricaine (in conformità con le Westerfield (5)) ai mass media per anestetizzare gli embrioni ed evitare movimenti durante l'esperimento.
- Posizionare con delicatezza la coda dell'embrione giù nel buco, e orientare in modo che l'apparato di iniezione si trova sul lato posteriore dell'embrione.
Parte 3: Iniezione del ventricolo cerebrale
- Per iniettare il ventricolo del cervello, disporre l'installazione di micromanipolazione in modo che la punta dell'ago sia nello stesso campo di vista come l'embrione ad alta potenza.
- Accuratamente messo l'ago attraverso la roofplate sottile del romboencefalo appena posteriore al hingepoint r0/r1 senza colpire il tessuto cerebrale sottostante.
- Iniettare quel tanto che basta colorante per riempire completamente i ventricoli. Si può richiedere diverse iniezioni per riempire lo spazio ventricolo, a seconda della fase dell'embrione.
Parte 4: immagini
- Con un panno pulito 1% agarosio rivestite piatto, fare buchi nuovi nel piatto, togliere le spine, e aggiungere tricaine per anestetizzare gli embrioni e di impedire il movimento.
- Mettere la coda del ventricolo-embrione iniettato nel foro e la posizione di un'immagine dorsale.
- Scattare una foto a luce trasmessa.
- E 'molto critico il movimento, non l'embrione o il microscopio.
- Modificare le impostazioni del microscopio e scattare una foto con la luce fluorescente.
- Riposizionare l'embrione per ottenere immagini laterale sia con luce trasmessa e luce fluorescente.
- Salvare le immagini come file TIFF per l'elaborazione delle immagini in Photoshop.
Parte 5: Image Processing
- Per elaborare le immagini in Photoshop, aprire la luce trasmessa e luce fluorescente immagini dell'embrione stesso preso nella stessa posizione. Assicurarsi che tutte le impostazioni sono le stesse per ogni immagine.
- Trascina l'immagine fluorescente sull'immagine luce trasmessa e allinearli esattamente.
- Con l'immagine fluorescente selezionata, selezionare "Immagine", "Regolazioni" e poi "Sostituisci colore" e modificare lo sfondo nero al bianco.
- Nella "Sostituisci colore" finestra regolare il fattore di "confusione" a destra fino a quando le immagini fluorescenti appare di colore uniforme.
- Nella finestra "Livelli", selezionate "Multiply" per visualizzare le immagini sovrapposte. La tua immagine spazio ventricolo deve corrispondere l'immagine trasmessa luce esattamente.
- Salvare il file e ripetere per altre immagini.
Risultati rappresentante / Esito
Una corretta immagini iniezione ventricolo sono mostrati in figura 1 pannelli dC, mentre un esempio di immagini di iniezione non corretti sono riportati nella EH. Iniezioni corretto avere spigoli vivi e non diffusa colorante. Iniezione errato, che si verifica quando l'ago viene inserito troppo in là nel ventricolo e colpisce il tessuto cerebrale sottostante, può portare a colorante che è visibile al di fuori dello spazio ventricolo e nel tuorlo.
Figura 1. Ventricolo iniezioni di 25 embrioni hpf tipo selvatico. (AD) metodo di iniezione corretta e (EH) metodo di iniezione non corretti sono indicati come esempi. (A, E) le immagini brightfield dorsali con le corrispondenti immagini a fluorescenza (B, F) e la sovrapposizione delle immagini fluorescenti e campo chiaro (C, G) per i metodi di iniezione sia corrette e non corrette mostrato. Le frecce indicano le regioni in cui colorante è andato oltre lo spazio ventricolo del cervello a causa di un'iniezione ventricolo corretto (vedere "Risoluzione dei problemi"). Anteriore è a sinistra in tutte le immagini.
Risoluzione dei problemi:
| Problema Causa | Rimedio | |
| Sei schiacciamento l'embrione con l'ago. | L'ago è troppo ottuso o la punta è troppo grande. | Inizia con un nuovo ago e non rompere il più indietro. Smusso l'ago per renderlo tagliente come un ago della siringa. |
| Il colorante è in tutto l'embrione e il tuorlo (vedi Fig. 1E-H). | L'ago ha attraversato il tessuto e non stare nello spazio ventricolo. | L'ago potrebbe non essere abbastanza affilato, quindi non si riesce a controllare la velocità di foratura. |
| Il colorante è troppo debole o non nel proencefalo. | Non hai usato una pressione sufficientemente alta per l'iniezione, o l'ago non era abbastanza anteriore per raggiungere il proencefalo quando iniettato il colorante. | Aumentare la pressione di iniezione o di inserire il vostro ago leggermente più anteriore durante l'iniezione. È possibile inserire l'ago attraverso il mesencefalo romboencefalo confine se maggiori dettagli è necessario nel proencefalo. Si può anche semplicemente aspettare un po 'per la tintura di diffondere ulteriormente prima di imaging. |
| Le immagini fluorescenti sono scuri lungo i bordi dopo la sostituzione del colore in Photoshop. | Hai dimenticato di modificare l'impostazione "confusione" nella finestra di sostituire il colore. | Spostare la "confusione" tutta la strada a destra nella finestra di sostituire il colore. |
| L'ago non forare la roofplate rombencefalo. | L'ago non è tagliato in modo corretto. | Creare un nuovo ago. Se stai facendo un sacco di iniezioni potrebbe essere necessario aghi diversi come possono ottenere noiosa. |
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Discussion
In questo video ci dimostra come iniettare colorante fluorescente (Texas-Red destrano) nello sviluppo di zebrafish ventricoli del cervello. Questo metodo viene utilizzato per visualizzare lo spazio ventricolo del cervello in contrasto con la neuroepitelio circostante ed è estremamente utile per determinare la forma dello spazio ventricolo così come la forma del tessuto cerebrale circostante. Ci permette di comprendere meglio il processo di formazione del cervello del ventricolo e la morfogenesi del cervello nel tempo l'embrione vivo. Questa tecnica è un ottimo strumento per studiare il cervello difetti ventricolo formazione iniziale e per la caratterizzazione e lo studio di mutanti morfogenesi del cervello.
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Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare Anna Laura Lowery che ha sviluppato questa tecnica in laboratorio. HS è supportato da NIHMH70926. Jennifer Gutzman è stato sostenuto dalla CSBI / Merck borsa di studio post-dottorato.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps | Tool | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Capillary Tubes (needles) | Tools | Frederick Haer and Co. | 30-30-1 | |
| Agarose-Coated dishes | Tools | Agarose (Seakem GTG; Lonza) Dishes (Corning) | Agarose (50027) Dishes (430166) | Make agarose approximately 2-3 mm deep in the dish depending on the stage of embryo you are injecting |
| Dissecting Microscope | Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Microscope Camera with Fluorescence capabilities and with image capture software | Tools | |||
| 1-200 μ pipette tips | Tools | USA Scientific, Inc. | 1111-0806 | These are the perfect size to poke the holes in the agarose and have the embryos fit perfectly. |
| Photoshop | Image Analysis | Adobe | ||
| Embryo Loop | Tools | Make these yourself with a glass pipette and hair or fishing line and seal with beeswax. | ||
| Microinjector | Tools | Harvard Apparatus | PL1-100 | |
| Needle Puller | Tools | Sutter Instrument Co. | Settings (Heat 785, Pull 70, Velocity 40, Time 70). | |
| Micromanipulator | Tools | Narishige International | ||
| Fluorescent dye Texas-Red Dextran 70,000MW | Reagent | Molecular Probes, Life Technologies | D1830 | Other Molecular weights are available if desired. |
| Tricaine (3-aminobenzoic acid ethyl ester) | Reagent | Sigma-Aldrich | A-5040 | |
| Embryo Media | Reagent | According to Westerfield (5) |
References
- Gutzman, J. H. Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction. Mech. Dev. 125, 974-983 (2008).
- Lowery, L. A. Characterization and Classification of Zebrafish Brain Morphology Mutants. Anat. Rec. (Hoboken). 292, 94-106 (2009).
- Lowery, L. A., Sive, H. Initial formation of zebrafish brain ventricles occurs independently of circulation and requires the nagie oko and snakehead/atp1a1a.1 gene products. Development. 132, 2057-2067 (2005).
- Kimmel, C. B.
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish. , University of Oregon Press. (1995).
