Ein High-Throughput-Verfahren zur global Studie der Organellen-Morphologie in S. cerevisiae

Summary

GFP-Fusionsproteine ​​sind weit verbreitet, um Organellen durch konfokale Mikroskopie sichtbar zu machen. Allerdings Screening auf Mutationen, die die Morphologie der Organellen beeinflussen erfordert in der Regel individuelle Mutagenese und zeitaufwändig ist. Hier zeigen wir eine Methode, um gleichzeitig aufzunehmen Organellen-GFP-Marker in fast 5.000 Nicht-essentielle Gene in Hefe.

Abstract

High-Throughput-Methoden, um Protein-Lokalisierung oder Organellen Morphologie zu untersuchen ist ein effektives Werkzeug zur Untersuchung der Protein-Wechselwirkungen und kann dazu beitragen, einen umfassenden Verständnis der molekularen Mechanismen. In Saccharomyces cerevisiae, mit der Entwicklung der non-essential Gendeletion Array, können wir global Studie die Morphologie der verschiedenen Organellen wie das endoplasmatische Retikulum (ER) und die Mitochondrien mit GFP (oder eine Variante)-Marker in verschiedenen Gen-Hintergründen. Allerdings Einbeziehung GFP Marker in jeder einzelnen Mutanten individuell ist ein arbeitsintensiver Prozess. Hier beschreiben wir ein Verfahren, das routinemäßig in unserem Labor verwendet wird. Durch den Einsatz eines Roboters zum High-Density-Hefe-Arrays und Drogen Auswahl Techniken umgehen, können wir deutlich verkürzen den Zeitaufwand und erhöhen die Reproduzierbarkeit. In kurzen, überqueren wir eine GFP-markierten mitochondrialen Marker (APC1-GFP), um ein High-Density Array von 4.672 essentielle Gen-Deletionsmutanten durch Robot-Replik Pinning. Durch diploid Auswahl, Sporulation, Keimung und Dual-Marker Auswahl, gewinnen wir beide Allele. Als Ergebnis enthält jeder haploid einzigen mutierten APC1-GFP in ihrer genomischen Locus integriert. Jetzt können wir untersuchen die Morphologie der Mitochondrien in alle nicht unbedingt mutierte Hintergrund. Mit diesem High-Throughput-Ansatz können wir bequem studieren und beschreiben die Wege und Gene in der Vererbung und der Bildung von Organellen in einer genomweiten Einstellung beteiligt.

Protocol

Material und Methoden:

1. Hefestämme:
   • ACP1-GFP (GFP:: His): C-terminale GFP-Markierung von ACP1 wurde durch eine PCR-vermittelte homologe Rekombination unter Verwendung von Plasmid pKT128 (enthält GFP und HIS5) generiert. Positive Transformanten wurden durch konfokale Mikroskopie und Kolonie-PCR bestätigt. Der Stamm Hintergrund war BY7043 (MAT alpha can1Δ: STE2pr-lue2 lyp1Δ his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0) aus Boone lab (Tong und Boone, 2006).
   • Deletionsmutante Array (DMA) (xxx:: KanR): es ist ein Array von rund 5.000 Deletionsmutanten von nicht-essentiellen Gene. Alle diese essentiellen Gene wurden auf G418 klopfte. Der Stamm Hintergrund des Arrays ist BY4741 (MATa his3_1 leu2_0 met15_0 ura3_0). Unsere DMA wurde ursprünglich aus Boone Labor.
2. Die Einbeziehung ACP1-GFP in den DMA:
   
   Das folgende Protokoll zur Herstellung eines GFP-Array wird von der Synthetic Genetic Analysis (SGA) Technologie (Tong und Boone, 2006) mit Modifikationen angepasst. Alle Replik Pinning Schritte sind mit einem Singer ROTOR high-density Anordnen Robot-System durchgeführt. Alternativ kann die manuelle Pinning oder eine Flüssigkeit-basierte High-Density-Anordnen Roboters verwendet werden.
   
   Abkürzungen: YPD, Hefeextrakt-Pepton-Dextrose, SD, synthetische Dropout, LRK, Lue / Arg / Lys-Dropout Medien; LHRK, Lue / His / Arg / Lys-Dropout Medien
   
   Vorbereitung
   1. Wachsen Sie einen Rasen ACP1-GFP-Zellen durch Eingießen einer 5 ml über Nacht ACP1-GFP Kultur auf eine YPD Platte. Lassen Sie die Platte ausreichend trocknen durch eine Flamme oder in einem biologischen Abzug.
   2. Die Platte bei 30 ˚ C über Nacht.
   3. Mit Hilfe eines Roboters, array ACP1-GFP-Stamm auf 1536 Kolonien pro Platte. Zur gleichen Zeit bereiten eine neue Kopie des DMA durch Nachbildung Pinning auf YPD + G418-Platten.
   4. Die Inkubation bei 30 ˚ C über Nacht.
      
      Paarung und diploid Auswahl
      
      
   5. Mate die ACP1-GFP-Stamm mit der DMA von Replik Pinning und über-legen die Kolonien auf YPD-Platten.
   6. Die Inkubation bei 30 ˚ C über Nacht.
   7. Replica-Platte die Kolonien auf SD - His + G418-Platten zu wählen diploiden Zellen (MATa / MATalpha).
   8. Die Inkubation bei 30 ˚ C über Nacht.
      
      Sporulationg und Keimung
      
      
   9. Replica-Platte der diploiden Kolonien über eine verstärkte Sporulation Medien, die reduzierte Mengen an Kohlenstoff und Stickstoff-Quellen für die Bildung von meiotischen Sporen induzieren enthält.
   10. Die Inkubation bei 25 ˚ C für mindestens 5 Tage.
   11. Keimen die MATa meiotischen Nachkommen von Replika-Plattierung der Kolonien auf LRK Medien und inkubieren Sie die Platten bei 30 ˚ C für zwei Tage.
   12. Diese Medien werden induzieren die Keimung von haploiden Zellen, die aus Sporen. Da ein LUE2 Eröffnung Leserahmen (ORF) in der Mata-spezifische STE2 Förderer integriert ist, werden alle Haploiden gekeimt MATa werden.
       
       Die Auswahl der beiden Allele
       
       
   13. Es ist jetzt notwendig, um sowohl die GFP-Allel und dem einzigen mutierten Allels zu wählen. Um dies zu erreichen, sind MATa Zellen replica-plated auf LRK + G418 Medien, die für die haploiden Zellen, die das Gen-Deletion (xxx:: kanR) tragen wählt.
   14. Die Inkubation bei 30 ˚ C über Nacht.
   15. Schließlich werden die MATa meiotischen Nachkommen replica-plated auf LHRK + G418 Medien für das Wachstum der einzelnen Mutanten (xxx:: kanR) wählen auch beherbergen ACP1-GFP (GFP:: His). Diese Platten können bei 4 ˚ C für bis zu 3 Monaten.
   
   
   Das folgende Protokoll zur Herstellung eines GFP-Array wird von der Synthetic Genetic Analysis (SGA) Technologie (Tong und Boone, 2006) mit Modifikationen angepasst. Alle Replik Pinning Schritte sind mit einem Singer ROTOR high-density Anordnen Robot-System durchgeführt. Alternativ kann die manuelle Pinning oder eine Flüssigkeit-basierte High-Density-Anordnen Roboters verwendet werden.
   
   Abkürzungen: YPD, Hefeextrakt-Pepton-Dextrose, SD, synthetische Dropout, LRK, Lue / Arg / Lys-Dropout Medien; LHRK, Lue / His / Arg / Lys-Dropout Medien
   
   Vorbereitung
3. Mikroskopie:
   1. Wählen Sie die gewünschte Mutante (s) zum Ausdruck ACP1-GFP direkt von der Platte.
   2. Wachsen Zellen bei 30 ° C in YPD-oder SD - Seine Medien frühen log-Phase.
   3. Visualisieren Sie mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie mit der GFP Filtersatz. Ein Beispiel für zu erwartende Ergebnis wird in Abbildung 1.

SGA-Medien:

Das Wachstum Medien (YPD) und wählen Sie Medien (SD) in diesem Protokoll verwendet wird routinemäßig in Hefe Molekularbiologie. Bitte beachten Sie Methods in Hefe (Amberg et al., 2005) für detaillierte Beschreibungen.

LRK, LHRK Medien (für 400 ml gesamt)

Fügen Sie in Ordnung	Betrag
Hefe Stickstoffbase mit Ammoniumsulfat	2,7 g
AminosäureMischung	0,8 g
Agar	8 g
dH 2 O	360 ml
Autoclave
20% Dextrose	40 ml
Abkühlen auf 65 ˚ C
100 mg / ml Canavanin	0,2 ml
100 mg / ml thialysine	0,2 ml
Mix, pour 50 ml pro Platte

LRK, LHRK + G418 Media (für 400 ml gesamt)

Fügen Sie in Ordnung	Betrag
Hefe Stickstoffbase ohne Ammoniumsulfat	0,7 g
Aminosäure-Mix	0,8 g
Mononatriumglutamat	0,4
Agar	8 g
dH 2 O	360 ml
Autoclave
20% Dextrose	40 ml
Abkühlen auf 65 ˚ C
100 mg / ml Canavanin	0,2 ml
100 mg / ml thialysine	0,2 ml
200 mg / ml G418	0,4 ml
Mix, pour 50 ml pro Platte

Angereichert Sporulation Medien (für 400 ml gesamt)

Fügen Sie in Ordnung	Betrag
Kaliumacetat	4 g
Hefeextrakt	0,4 g
Traubenzucker	0,2 g
Sporulation Aminosäure-Mix	0,04 g
Agar	8 g
dH 2 O	360 ml
Autoclave
Abkühlen auf 65 ˚ C
200 mg / ml G418	0,4 ml
Mix, pour 50 ml pro Platte

Discussion

Diese Methode kann effektiv helfen enthalten eine mitochondriale Marker, ACP1-GFP in verschiedenen Mutanten Hintergrund. Es beruht auf der Verwendung eines Robot-System, und kann leicht für die Verwendung mit jedem Roboter-System übernommen. Dieses Verfahren kann auch für die Einbeziehung anderer Arten von Markierungen verwendet werden. Zum Beispiel, zu visualisieren ER, verwenden wir routinemäßig die Markierung ERG11-GFP. In unserer repräsentativen Bilder, ein mutiertes und ein Wildtyp mit der ACP1-GFP-Hersteller waren Visu ed durch konfokale Mikroskopie, die Mitochondrien-Morphologie zu studieren. Die Mutante zeigte gestört mitochondrialen Phänotyp und ist daher ein guter Kandidat für eine weitere Untersuchung.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SGA media			The growth media (YPD) and synthetic dropout media (SD) including LRK and LHRK, and enriched sporulation media used in this protocol is routinely used in yeast molecular biology. Please refer to Methods in Yeast (Amberg et al., 2005) for detailed descriptions.