Summary
GFP-синтез белков широко используется для визуализации органелл с помощью конфокальной микроскопии. Тем не менее, скрининг на мутации, которые влияют на морфологию органелл как правило, требует отдельного мутагенеза и занимает много времени. Здесь мы демонстрируем метод одновременно включить органелл-GFP маркеров в почти 5000 несущественные генов у дрожжей.
Abstract
Высокая пропускная способность методов для изучения локализации белка или органелл морфологии является эффективным инструментом для изучения белковых взаимодействий и может помочь в достижении полного понимания молекулярных путей. В CEREVISIAE Saccharomyces, с развитием несущественные массив удаления гена, мы можем глобально исследования морфологии различных органелл, как эндоплазматический ретикулум (ER) и митохондрии использованием GFP (или вариант)-маркеров в разных слоев гена. Однако, включив GFP маркеров в каждом отдельном мутант отдельности трудоемкий процесс. Здесь мы описываем процедуры, которая обычно используется в нашей лаборатории. С помощью роботизированной системы для обработки с высокой плотностью дрожжей массивы и методы препарат выбора, мы можем значительно сократить время, необходимое и повышения воспроизводимости. Короче говоря, мы пересекаем GFP с метками митохондриального маркера (Apc1-GFP), чтобы с высокой плотностью массива 4672 несущественные мутантов удаления гена роботов реплики пиннинга. Через диплоидных отбора, спорообразование, прорастание и двойной выбор маркера, мы возвращаемся обоих аллелей. В результате, каждый гаплоидных одного мутанта содержит Apc1-GFP включены в его геномной локуса. Теперь мы можем изучить морфологию митохондрий во всех несущественных мутант фоне. С помощью этой высокой пропускной подход, мы можем удобно изучать и определять пути и гены, участвующие в наследство и образования органелл генома обстановке.
Protocol
Материалы и методы:
- Дрожжи штаммов:
- Acp1-GFP (GFP:: Его): С-концевой GFP-маркировка Acp1 был сгенерирован ПЦР-опосредованной гомологичной рекомбинации использованием плазмиды pKT128 (содержит GFP и HIS5). Положительные трансформанты были подтверждены конфокальной микроскопии и колонии PCR. Напряжение фона BY7043 (MAT альфа can1Δ:: STE2pr-lue2 lyp1Δ his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0) из лаборатории Бун (Tong и Бун, 2006).
- Удаление Мутант Array (DMA) (ххх:: KanR): она представляет собой массив из примерно 5000 удаление мутантов несущественные генов. Все эти несущественные генов были выбиты на G418. Напряжение фоне массива BY4741 (МАТА his3_1 leu2_0 met15_0 ura3_0). Наши DMA была родом из Бун лаборатории.
- Включение Acp1-GFP в DMA:
Следующий протокол для принятия GFP массив адаптировано из синтетического генетический анализ (SGA) технологии (Tong и Бун, 2006) с изменениями. Все реплики шаги пиннинга делается с помощью Певица РОТОР высокой плотности arraying роботизированной системы. Кроме того, ручной фиксации или жидкой основе высокой плотности arraying робот может быть использован.
Сокращения: YPD, дрожжевой экстракт, пептон-глюкоза, SD, синтетические отсева; ЗРК, Лю / Arg / Lys отсева информации; LHRK, Лю / Его / Arg / Lys отсева СМИ
Подготовка- Вырастить газон Acp1-GFP клетки при заливке 5 мл ночь Acp1-GFP культуры на YPD пластины. Разрешить пластине высохнуть достаточно пламенем или в биологических вытяжной шкаф.
- Инкубируйте планшет при 30 ˚ С в течение ночи.
- Использование робота, массив Acp1-GFP перелить в 1536 колоний на чашку. В то же время, подготовить новую копию DMA на реплику пиннинга к YPD + G418 пластин.
- Инкубируйте пластин при 30 ˚ С в течение ночи.
Спаривание и диплоидных выбор - Мате Acp1-GFP штамма с DMA на реплику пиннинга и более прокладки колонии на YPD пластин.
- Инкубируйте пластин при 30 ˚ С в течение ночи.
- Реплика пластины колоний на SD - Его G418 + пластины, чтобы выбрать диплоидных клеток (МАТА / MATalpha).
- Инкубируйте пластин при 30 ˚ С в течение ночи.
Sporulationg и прорастание - Реплика пластины диплоидных колоний на расширение медиа споруляции, который содержит снижение уровня углерода и азота источников, чтобы вызвать образование мейоза спор.
- Инкубируйте пластин при 25 ˚ С в течение минимум 5 дней.
- Прорастают МАТА мейоза потомства от реплики-покрытие колоний на ЗРК СМИ и инкубировать пластин при 30 ˚ С в течение двух дней.
- Этот носитель будет стимулировать прорастание гаплоидных клеток из спор. С LUE2 рамки считывания открытия (ORF) интегрируется в Мата-промоутер конкретных STE2, все гаплоидов проросшие будет Мата.
Выбор обоих аллелей - Теперь необходимо выбрать оба аллеля GFP и один мутантный аллель. Чтобы достичь этого, Мата клетки реплики покрытием на ЗРК + G418 СМИ, которые выбирает для гаплоидные клетки, которые несут ген удаления (ххх:: kanR).
- Инкубируйте пластин при 30 ˚ С в течение ночи.
- Наконец, МАТА мейоза потомства являются репликой покрытием на LHRK + G418 средств массовой информации, чтобы выбрать для роста одиночных мутантов (ххх:: kanR) также укрывательство Acp1-GFP (GFP:: Его). Эти плиты можно хранить при 4 ˚ C в течение 3 месяцев.
Следующий протокол для принятия GFP массив адаптировано из синтетического генетический анализ (SGA) технологии (Tong и Бун, 2006) с изменениями. Все реплики шаги пиннинга делается с помощью Певица РОТОР высокой плотности arraying роботизированной системы. Кроме того, ручной фиксации или жидкой основе высокой плотности arraying робот может быть использован.
Сокращения: YPD, дрожжевой экстракт, пептон-глюкоза, SD, синтетические отсева; ЗРК, Лю / Arg / Lys отсева информации; LHRK, Лю / Его / Arg / Lys отсева СМИ
Подготовка - Микроскопия:
- Выберите желаемую мутант (ы), выражающая Acp1-GFP непосредственно из пластины.
- Рост клеток при 30 ° С в YPD или SD - Его средства массовой информации до начала фазы журнала.
- Визуализация с помощью конфокальной микроскопии с использованием GFP filterset. Примером ожидаемый результат показан на рисунке 1.
SGA СМИ:
Питательной среды (YPD) и выборе носителя (SD), используемые в настоящем протоколе обычно используется в дрожжах молекулярной биологии. Пожалуйста, обратитесь к методам в дрожжи (Амберг и соавт., 2005) для подробного описания.
ЗРК, LHRK СМИ (на 400 мл общего числа)
| Добавить в заказ | Количество |
| Дрожжи азотистого основания сульфатом аммония | 2,7 г |
| Аминокислотасмесь | 0,8 г |
| Агар | 8 г |
| дН 2 O | 360 мл |
| Автоклав | |
| 20% раствор глюкозы | 40 мл |
| Остудить до 65 ˚ C | |
| 100 мг / мл canavanine | 0,2 мл |
| 100 мг / мл thialysine | 0,2 мл |
| Смешать, залить 50 мл на чашку | |
ЗРК, LHRK + G418 СМИ (на 400 мл общего числа)
| Добавить в заказ | Количество |
| Дрожжи азотистого основания, без сульфата аммония | 0,7 г |
| Amino смесь кислоты | 0,8 г |
| Глутамат натрия | 0,4 |
| Агар | 8 г |
| дН 2 O | 360 мл |
| Автоклав | |
| 20% раствор глюкозы | 40 мл |
| Остудить до 65 ˚ C | |
| 100 мг / мл canavanine | 0,2 мл |
| 100 мг / мл thialysine | 0,2 мл |
| 200 мг / мл G418 | 0,4 мл |
| Смешать, залить 50 мл на чашку | |
Обогащенный споруляции СМИ (на 400 мл общего числа)
| Добавить в заказ | Количество |
| Калия ацетат | 4 г |
| Дрожжевой экстракт | 0,4 г |
| Декстроза | 0,2 г |
| Плодоношение аминокислот смеси кислот | 0,04 г |
| Агар | 8 г |
| дН 2 O | 360 мл |
| Автоклав | |
| Остудить до 65 ˚ C | |
| 200 мг / мл G418 | 0,4 мл |
| Смешать, залить 50 мл на чашку | |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот метод может помочь эффективно включать митохондриального маркера, Acp1-GFP в различных мутантов фонов. Она основана на использовании роботизированной системы, и может быть легко принята для использования с любыми роботизированной системы. Эта процедура может также использоваться для включения других типов маркеров. Например, для визуализации ER, мы обычно используем маркер Erg11-GFP. В наш представитель изображений, мутанта и дикого типа с Acp1-GFP производителя были visualiz ред помощью конфокальной микроскопии для исследования морфологии митохондрий. Мутант показал нарушена митохондриальной фенотип, и, следовательно, является хорошим кандидатом для дальнейшего расследования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана биотехнологии и биологических наук Исследовательского Совета (грант 31/C15982), канадского института исследований в области здравоохранения, Канада Фонд инноваций, знаний британской Колумбии Фонд развития, Майкл Смит Фонда медицинских исследований (грант на CJR Лоуэн), и бороться за зрение.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SGA media | The growth media (YPD) and synthetic dropout media (SD) including LRK and LHRK, and enriched sporulation media used in this protocol is routinely used in yeast molecular biology. Please refer to Methods in Yeast (Amberg et al., 2005) for detailed descriptions. |
References
- Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. Methods in yeast genetics : a Cold Spring Harbor Laboratory course manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2005).
- Tong, A. H., Boone, C. Synthetic genetic array analysis in Saccharomyces cerevisiae. Methods Mol Biol. 313, 171-192 (2006).
