Summary
Aqui nós descrevemos uma nova técnica proteômica quantitativa para a identificação de complexos de proteína em Saccharomyces cerevisiae. Neste estudo, nós utilizamos o método SILAC juntamente com purificação de afinidade seguido por espectrometria de massa para identificar com alta especificidade dos parceiros de ligação de uma proteína ER, Scs2p.
Abstract
Lipídios são os blocos de construção das membranas celulares que funcionam como barreiras e na compartimentalização de processos celulares e, recentemente, como importantes moléculas sinalizadoras intracelulares. No entanto, ao contrário de proteínas, lipídios são pequenas moléculas hidrofóbicas que o tráfego principalmente pelo mal descritos rotas não vesiculares, que são a hipótese de ocorrer em locais de contato da membrana (MCS). MCS são regiões onde o retículo endoplasmático (ER) faz o contato físico direto com uma organela parceria, por exemplo, membrana plasmática (PM). A porção de ER ER-PM MCS é enriquecida em lipídios, síntese de enzimas, sugerindo que a síntese lipídica é direcionado para esses sites e dando a entender que SMCs são importantes para o tráfego de lipídios. A levedura é um modelo ideal para estudar ER-PM SMCs por causa de sua abundância, com mais de 1.000 contatos por celular, e sua natureza preservada em todos os eucariontes. Descobrindo as proteínas que constituem MCS é fundamental para a compreensão de como o tráfego de lipídios é realizada nas células, e como eles agem como moléculas de sinalização. Descobrimos que uma ER chamado Scs2p localizar a ER-PM MCS e é importante para sua formação. Estamos focados em descobrir os parceiros moleculares da Scs2p. Identificação de complexos de proteínas tradicionalmente se baseia em primeiro resolver amostras de proteínas purificadas por eletroforese em gel, seguido por in-gel a digestão de bandas de proteínas e análise de peptídeos por espectrometria de massa. Isso muitas vezes limita o estudo a um pequeno subconjunto de proteínas. Além disso, complexos de proteínas são expostas a desnaturação ou condições não fisiológicas durante o procedimento. Para contornar esses problemas, temos implementado um grande escala técnica proteômica quantitativa para extrair dados imparciais e quantificados. Usamos rotulagem isótopo estável com aminoácidos em cultura de células (SILAC) para incorporar os núcleos de isótopos grampo em proteínas em uma estirpe de controlo untagged. Volumes iguais de cultura marcados e não marcados cultura, SILAC-rotulados são misturados e lisadas por moagem em nitrogênio líquido. Em seguida, realizar um processo de purificação de afinidade para puxar para baixo complexos de proteína. Finalmente, precipitar a amostra de proteína, que está pronto para análise por cromatografia líquida / espectrometria de massa tandem. Mais importante ainda, proteínas em uma estirpe de controlo são rotulados pela isótopo pesado e produzirá uma mudança em massa / carga que pode ser quantificado contra as proteínas não marcado na cepa isca. Portanto, contaminantes, ou ligação inespecífica pode ser facilmente eliminada. Usando essa abordagem, identificamos várias novas proteínas que localizar a ER-PM MCS. Aqui nós apresentamos uma descrição detalhada da nossa abordagem.
Protocol
Materiais e Métodos
- Cepas de leveduras
- Todas as cepas utilizadas neste estudo são baseados no fundo BY4742. Da estirpe do controlo SILAC (Mat a, his3, leu2, ura3, lys2 e arg4:: G418) foi feita por meio de cruzamentos arg4 tensão exclusão (Mat a, his3, ura3, leu2 e arg4:: G418) para BY4742 (Mat alfa, his3, leu2, ura3 e lys2), e as haplóides meióticas foram obtidas por dissecção tétrade. Portanto, a tensão de controle é um auxotroph de lisina e arginina. A cepa isca foi feita por PCR mediada por recombinação homóloga usando o vetor pBS1479. Portanto, a tag epítopo utilizado neste estudo é a purificação de afinidade tandem (TAP) tag (3).
- SILAC:
- Da estirpe do controlo SILAC foi cultivado em meios de abandono mínimo suplementado com 98% L-lisina-4 ,4,5,5-D4 (0,03 g / L, Cambridge Isotope) e 98% L-arginina-13 C 6 (0,036 g / L, Cambridge Isotope).
- A cepa isca foi cultivada em meio rico regular com normais isotópica aminoácidos.
- Primeira etapa de purificação TAP [Este protocolo é adaptado a partir do Cold Spring Harbor curso de laboratório manual (4)]
** A noite antes da sua purificação, argamassa pré-chill e pilão em freezer -80 ° C. Além disso, pré-chill um copo em -20 ° C **
Tornar esses buffers direito antes de usar (para 1 L de cultura):- 30 ml NP-40 com 25 de buffer PIC mL (1 / 2000), 50 ul da TDT 1M
- 20 ml de tampão NP-40 com 1 / 200 PIC, 50 ul de 1M TDT
- 10 ml de TEV-C buffer com 1 / 2000 PIC, 10 ml de 1 M DTT
SILAC e preparação
- Grow 1L cada um dos tensão isca eo controle de tensão em separado para = 1,0-1,3 OD 600.
- Despeje a cultura em tubos de centrífuga de 500ml Nalgene. Equilibrar a carga e células de pelotização em 2580X g.
- Decantar mídia e ressuspender pellet com 50ml de frio dH 2 O durante a transferência das células para tubos de centrífuga de 50ml. Células da pelota. ** Você pode congelar o pellet a -80 ° C **
- ** Importante ** coincidir com a cultura estirpe de controlo para a cultura tensão isca em 1:1 em peso pellet seco.
- Ressuspender cada pellet celular em 10ml de NP-40 buffer com Cocktail 1 / / 2000 Inibidor da Protease (PIC).
- Misturar as duas culturas de células de decantação um tubo diretamente para o outro.
Grinding - Despeje o líquido em N 2 a argamassa pré-refrigeradas e permitir que ele evapore completamente. Adicionar 2 ml de células para a argamassa em movimento circular. Despeje um pouco de N 2 líquido para congelar as células. Moer as células até as células se tornam pó fino. Repita o processo até que todas as células são chão. ** Não deixe que as células para descongelar. Add N 2 líquido quando necessário **
- Transferir o pó para um copo gelado e descongele em temperatura ambiente. Quando as bordas começam a derreter, adicione 20 ml de tampão NP-40 com 1 / 200 PIC.
- Transferência de lisado bruto para tubos de 40 ml Nalgene. Giram em 39.000 xgfor 30 min.
- Enquanto espera, tomar 300 ml de contas Sepharose 2B (GE). Lave as contas em 300 l de tampão NP-40 (1 / 2, 000 PIC) 3 vezes. Volte a suspender as contas em 300 mL de buffer para que eles sejam, numa suspensão de 1:1.
Pré-limpeza lisado celular - Transfira o sobrenadante para um novo tubo e adicionar as contas 2B Sepharose. Incubar em uma plataforma rotativa, em câmara fria por 30 min.
- Enquanto espera, tomar 300 ml de IgG Sepharose 6 contas (GE). Lave as contas em 300 l de tampão NP-40 (1 / 2, 000 PIC) 3 vezes. Volte a suspender as contas em 300 _l tampão para que eles sejam, numa suspensão de 1:1.
- Pellet as contas. Transfira o sobrenadante para um novo tubo. ** Salve uma alíquota do lisado celular para Western Blotting tarde **
Ligação a contas de IgG sepharose - Remova as contas 2B Sepharose por centrifugação. Adicionar as contas IgG (previamente preparado em 1:1 slurry). Separar os conteúdos em dois tubos para a ligação mais eficiente. Incubar em uma plataforma rotativa, em câmara fria por 2 horas.
- Girar as esferas. ** Salve uma alíquota da facção unbound **
- Lavar contas com 10 ml de tampão NP-40 (02/01, 000 PIC).
- Lavar contas com 3 ml TEV-C buffer (02/01, 000 PIC). ** Salve uma alíquota das esferas. Isso irá refletir a eficiência da ligação **
Eluição de contas de IgG por TEV clivagem da protease - Adicionar 5 mL de AcTEV para 1ml de TEV-C-tampão (com 1 / 2, 000 PIC). Depois de misturar, separar o conteúdo em dois tubos de 1,5 ml para mais Eppendorf mistura eficiente. Incubar em uma plataforma rotativa no quarto frio durante a noite.
- Spin para baixo as contas e transferir o eluato para um tubo de 1,5 ml de frescor. Lave as contas com 0,5 ml adicional de TEV-C tampão
- Combine o elaute em um tubo. Você deve ter 1,5 ml de eluído no total.** Salve uma alíquota do eluato TEV **
Ácido tricloroacético precipatation (TCA) (Para a análise de espectrometria de massa-base, recomendamos o uso de EtOH / precipitação de acetato) - Ajustar as alíquotas de 25% TCA com 100% de TCA. Para fazer isso, separar o eluato 1,5 ml em 2 tubos de 750 mL cada. Adicionar 250 mL de TCA 100% para o tubo. Sua solução deve girar leitoso.
- Colocar no gelo por 30 minutos com vortex periódica.
- Giram em velocidade máxima na centrífuga de mesa na sala fria por 30 min.
- Lave uma vez com 500 mL de acetona gelada contendo 0,05 N HCl e girar por 5 min em velocidade máxima (sala fria).
- Lave uma vez com 500 mL de acetona gelada e girar por 5 min no max (sala fria).
- Remova cuidadosamente acetona e pellet seco.
- Para a coloração de prata, ressuspender o sedimento em 50 ul de 1X tampão de amostra SDS.
EtOH precipatation / acetato - Adicionar 20 mg de glicogênio
- Diluir as amostras de 5X com EtOH 100% e ajuste para 50 mM nach 3 COO com um estoque 2,5 M, pH 5,0
- Suportar a solução para 2hr
- Pellet proteína precipitada por centrifugação por 10 min a 12.000 X g à temperatura ambiente.
NP-40 Buffer (para 200 ml)
| Concentração de ações | Adicionar | |
| 10 mM tampão fosfato de sódio (pH 7,2) | 0,1 M | 20 ml |
| 150 mM NaCl | 2 M | 15 ml |
| 1% NP-40 | 100% | 2 ml |
| 50 mM NaF | 1 M | 10 ml |
| 0,1 mM Na 3 VO 4 | 10 mM | 2 ml |
| Volume para 200 ml | ||
ADD antes de usar:
- 01/01, de 1 000 M DTT
- 02/01, 000 do PIC (Protease Cocktail Inibidores)
TEV-C Buffer (para 50 ml)
| Concentração de ações | Adicionar | |
| 25 mM Tris (pH 8,0) | 100 mM | 12,5 ml |
| 150 mM NaCl | 2 M | 3,75 ml |
| 0,1% NP-40 | 100% | 50 _l |
| 0,5 mM EDTA | 500 mM | 50 __l |
| Volume para 50 ml | ||
ADD antes de usar:
- 01/01, 000 de 1M TDT
- 02/01, 000 do PIC
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Discussion
As alíquotas salvo durante o processo de purificação deve incluir (1) lisado celular pré-limpo, (2) fração ligada, (3) fracção livre, e (4) fração eluída. Recomendamos analisar o conteúdo de proteína das alíquotas acima por Western blotting utilizando anticorpo anti-TAP ou coloração pela prata para refletir a eficiência de ligação e eluição do experimento. Exemplos de um gel de prata manchada e uma mancha são mostrados na Figura 1.
Desde SILAC nos fornece medições imparcial e quantificados de parceiros de ligação às proteínas, só fazemos a primeira etapa da purificação TAP para minimizar a perda da amostra. Se você tiver uma quantidade significativa de ligação inespecífica, talvez você queira realizar todo o protocolo, o que pode ser encontrado no Cold Spring Harbor manual (4).
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References
- Loewen, C. J. Inheritance of cortical ER in yeast is required for normal septin organization. Jour. Cell Biol. 179, 467-483 Forthcoming.
- Ong, S., Foster, L. J., Hoog, C. L., Mann, M. Mass spectrometric-based approaches in quantitative proteomics. Methods. 29, 124-130 Forthcoming.
- Puig, O. The Tandem Affinity Purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 Forthcoming.
- Amberg, D. C., Burke, D. J., Strathern, J. N.
