Summary
꿀벌은 appetitive 후각 학습 패러다임 (당 시설)에서 시설 수 있습니다. 자극과 같은 냄새를 사용하여, 우리는 동시에 칼슘 이미징이 버섯 신체 뉴런에서 냄새 evoked 활동을 측정하는 데 사용하는 동안 기록되는 행동 방식을 설립
Abstract
생체내 및 반에서 칼슘 이미징에 대한 생체내 준비가 Joerges, Küttner 및 Galizia에 의해 우리가 실험실에서 개발되었습니다의 이상 십년 전, antennal 엽 1 냄새 evoked 활동을 측정합니다. 그때부터, 그것은 지속적으로 세련되었고 비 두뇌에서 다른 neuropiles에 적용. 여기서 우리는 현재 dextran 결합 칼슘에 민감한 염료를 (Fura - 2)를 사용하여 버섯 신체 뉴런의 활동을 측정하기 위하여 실험실에서 사용되는 준비를 설명합니다. 우리는 retrogradely 자신의 axons 또는 소마 지역에 염료를 주입하여 버섯 신체 뉴런을 얼룩. 우리는 에어컨 PER 사용하여 꿀벌을 양성 볼 수 있습니다있는 준비를 달성하기 위해, invasiveness을 줄이는 데 중점을 둡니다. 우리는 PER (M17) 2를 제어하는 근육에서 전자 myograms을 기록하여 행동 반응을 모니터링하고 정할 수 있습니다.
생리 실험 후 몇 군데 구조는 뉴런의 신원을 주소로 공촛점 스캐닝 현미경을 사용하여보다 상세히 조사하고 있습니다.
Protocol
비 준비 및 백 - 채우기
- 고정을위한 얼음 하이브와 감기에 꿀 비 foragers을 관람해보세요.
- 플렉시가 실 3 녹화에 탑재합니다. 낮은 융점 하드 왁스로 녹음 챔버 벽에 눈과 흉부을 수정.
- 일반적으로 전기 생리학 사용으로 유리 모세관을 당겨 및 CA의 팁 직경을 얻는 끝에 휴식. 10μm. 염색 붙여있는 모세관의 끝부분을 커버. 다이 붙여넣기 Fura - 2 dextran과 리신 고칠수 tetramethylrhodamine dextran의 10시 1분 혼합물로 구성되어 있습니다.
- 얼룩 절차에 대한 세밀한 점 또는 N - eicosane와 안테나를 무력화. 두뇌 위의 표피의 일부를 제거하고 버섯 본문에 대한 액세스를 허용하는쪽으로 분비 및 기관 밀어.
- 소마 또는 버섯 신체 뉴런의 axonal 지역 중 하나에 모세 혈관을 주입. 이것은 무료로 손으로 일을하거나 마이크로 조작하는 사람을 사용하실 수 있습니다. 그런 다음 머리를 캡슐에 표피 조각을 복원하고 안테나를 푸세요.
- 20 적어도 4 시간 동안 humidified 경우에 그들을 저장하기 전에 야간 이상 30 % 자당 솔루션 꿀벌 먹이 ° C.
생체내 이미징에
- 복부에 대한 눌렀을 및 기록 챔버에 클립이나 테이프로 고정 스펀지의 작은 조각으로 비 예의 움직임을 방지합니다.
- 식도의 펌핑으로 인한 두뇌의 움직임을 방지하기 위해, labrum 위의 표피에 작은 절개를 잘라 조심스럽게 식도를 꺼내와 그 주변 단단한 구조 식도 4 손상없이 긴장 밑에 넣고. 이 구성 요소의 실리콘과 커버.
- 바늘로 구멍을 만들어 M17의 녹음 와이어 전극을 삽입합니다.
- 표피 조각, 기관 및 뇌 이상 분비를 제거합니다. 종이로 헤드 캡슐 내부 heamolymph 석.
- 이 구성 요소의 실리콘으로 헤드 캡슐을 입력합니다. 두뇌가 완전히 덮여 것이 중요합니다.
- 플레이스 현미경 스테이지에서 꿀벌과 비말에 현미경의 딥 목적을 담가하는 실리콘의 표면에 물 한 방울을 넣으십시오. 스테인드 뉴런에 중점을두고 있습니다.
신호의 냄새 자극 및 녹화
Olfactometer : 우리는 컴퓨터를 제어, 사용자 지정 구축 자극 장치 또는 Galizia와 베터 3 이전에 설명한 것처럼 "olfactometer"를 사용합니다. 냄새는 안테나 향해 감독 일정한 공기 흐름으로 희석하고 있습니다. 모든 자극은 0.2ml 냄새 포화 공기의 3S로 냄새 펄스로 구성되어 있습니다. 자극 프로토콜은 레코딩 소프트웨어 TILLVision에서 설정할 수 있습니다.
설정 현미경 및 이미징 : 우리는 자이스 혈구 형광 현미경을 사용합니다. 이미지는 25 ° 현미경에 장착된까지 - Photonics 이미징 장치를 사용하여 5 Hz의 샘플링 속도와 C로 기록됩니다. 칼슘 신호는 X60, 0.9 W 올림푸스 성충 CCD 카메라 (640x480에서 픽셀, 160X120 픽셀 칩 binned 4X)와 함께 수영을 객관적으로 기록됩니다. Fura - 2는 단색 340의 빛과 ratiometric 측정 파장을 380nm로 흥분합니다. 형광은 410nm 이색성 거울과 440nm 긴 통과 필터를 통해 감지됩니다. 기록에 대한 매개 변수는 레코딩 소프트웨어에서 설정합니다. 각 측정은 두 개의 파장에 대해 10 초 및 노출 시간 각 준비에 얼룩 강도 조정될 수 있습니다 지속.
M17 녹음 : labium (M17)의 오래 끄는 근육이 학습과 관련된 행동 반응을 모니터하는 extracellularly 기록됩니다 PER 5 6 즉. 입 부분에 가까운 근육에 구리 철사를 삽입. 눈에 접지 전극을 삽입. 근육 잠재력은 사용자 지정 빌드 사전 증폭기로 증폭된 디지털 및 컴퓨터에 저장됩니다. 자극 증상은 olfactometer에 의해 트리거됩니다.
데이터 분석
- 실험을 진행하는 동안 : 칼슘 신호의 녹음은 컴퓨터에 공급하고 저장됩니다. 레코딩 소프트웨어 TILLVision의 파장 (340nm/380nm)와 deltaF (기준의 뺄셈)의 계산 간의 비율 계산 같은 신호의 초기 검사를하실 수 있습니다.
- 이미지 처리는 IDL로 작성된 사용자 정의 프로그램이 수행됩니다. 칼슘 2 비율 + 340nm에서 신호를 각 픽셀에 대한 380nm 측정을 계산합니다. 자극 전에 프레임을 통해 평균하여 형광 배경 (F)을 확인하고 ratiometric 신호 (deltaF)에서 빼야.
- 관심 (ROI)의 지역을 정의하려면 다음과 같이 자극하는 동안 프레임의 의미와 저역 통과 필터 (3X3px)를 적용 계산합니다. 잘못된 색상 규모에 그레이 스케일로 변환. 거짓 컬러 이미지에서 활동 명소로의 연결 구조 활동을 파악하고 투자 수익 (ROI)로 정의합니다.
- 어떤 필터링이나 수정없이 프레임 이상의 투자 수익 (ROI)의 픽셀을 평균하여 활성 영역의 관자놀이 역학을 계산합니다.
함께 Fura - 2 dextran과 함께 우리는 고칠수 염료 rhodamine dextran ( "미니 루비")과 뉴런을 입력합니다. 두 염료 같은 분자량을 가지고, 그들은 뉴런에 공동 위치해야합니다. 와이드 필드 영상은 매우 제한된 공간 해상도를 허용, 따라서 그것은 공촛점 스캐닝 현미경을 사용하여 실험 후 스테인드 구조를 조사하는 것이 좋습니다.
- 생리적 측정 후, 머리를 해부하다하고 흥분시키는.
- PBS 및 에탄올과 메틸 salycilate의 혐의 stepwise 탈수에 씻어.
- 공촛점 현미경에 대한 메틸 salycilate의 머리를 포함.
- 우리는 Leica TCS SP2 현미경을 사용합니다. 여기 파장은 543nm이다.
- 우리는 공기 또는 기름 침지 목적으로 두뇌를 스캔하고 이미지 데이터와 스테인드 구조를 비교합니다.
대표 결과 :
얼룩과 준비가 성공했다면, 허위 색상 규모의 신호, 버섯 신체 알파 엽 외부 뉴런에서 예를 들어, 그림 1처럼 보이게 수 있습니다.
행동 응답 (당) 자극 (figure2) 전에 자극 마이너스 스파이크 주파수 중에 스파이크 주파수로 계산하실 수 있습니다.
스테인드 구조는 공촛점 현미경 (figure3)를 사용하여보다 상세히 조사 수 있습니다.
그림 1 : 대표 칼슘 이미징 신호 (heptanal와 자극). A : 비 뇌의 몇 군데 지역. B : 380nm 여기 파장에서 X20 물놀이를 객관적으로 볼 수로 원료 형광 이미지, 버섯 본문의 알파 - 엽은 자주색으로 설명되어 있습니다. 염료는 불순물 뉴런을 얼룩이 알파 엽 (叶)의 ventro - 측면 가장자리에 주입했다. C : 삼초 자극하는 동안의 평균 신호 deltaF (380분의 340)에서 파생된 거짓 색상 이미지, 자주색에 명시된 알파 엽 선택한 투자 수익 (ROI)은 검정색으로 설명했다. D : 냄새 자극, C. E의 표시로 관심 지역에서 평균 신호에 대한 응답으로 칼슘 신호의 시간적 역학 : 투자 수익 (ROI)에 각각 자당의의 자극 ipsi과 콘트라 측면 안테나에 대한 응답으로 칼슘 신호의 시간적 역학 표시 C로
그림 2 : 대표 M17 응답. 후각 컨디셔닝 후 꿀벌 그 냄새가 보상없이 제시 코를 확장합니다. 레드 라인 냄새 자극을 나타냅니다. 삽입된 페이지 : 꿀벌의 PER.
그림 3 : 대표 이미지 스택. 이미징 실험 후 머리가 해부했다. 그림 1에서 신경 세포는 보라색에 명시된 X20 오일 침지 목표, 알파 - 엽과 공촛점 현미경을 사용하여 스캔합니다.
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Discussion
이 프레 젠 테이션에서 우리는 꿀벌의 생체내 칼슘 신호에 조사하기위한 모든 단계를 통과했습니다. 우리는 버섯 몸의 신경이 기술을 적용하지만, 이미지는 얼룩 기술이 확립 수있는 모든 뉴런에서 할 수 있습니다. 우리는 벌꿀 꿀벌의 후각 경로의 뉴런에 주력했습니다. 실험은 모든 암실에서 수행됩니다. 세트는 최대 꿀벌의 광학 인식 범위 밖으로 거짓과 염료를 자극하지 않는 긴 파도가 빛으로 조명됩니다. 실리콘 예를 공기 방울 들어, 형광 유물을 방지하는 것이 중요합니다.
이 시스템의 주요 장점 중 하나는 공간과 시간적 해상도를 가진 뉴런의 활동에 대한 정보를 맛볼 수있는 가능성이다. 뉴런의 예 : 학습 관련 소성가 조사되어야하는 때 동시에, 우리는 꿀벌에 관련된 행동을 관찰할 수 있습니다. 그러나, 공간과 시간적 해상도가 제한됩니다. 생체내 칼슘 이미징 사용하여, 실험 시간이 제한됩니다. 세포외 electrophysiological 방법으로 레코딩 몇 시간 또는 며칠 동안 지난 수 있지만, 우리의 실험은 약 90 분 제한됩니다. 우리가 5Hz의 샘플링 속도, 각 측정 지속 십초, 20ms 및 380nm 노출 지속 5ms되는 340nm 노출, 각각 두 파장의 여기와 85 측정을 수행할 때 신호는 여전히 비교적 잘하고 있습니다. 이후 문제가 될 수 있습니다 표백 염료.
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Acknowledgments
이 작품은 DFG에 의해 자금입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| low melting point hard wax Deiberit 502 | Dr. Böhme Schöps Dental GmbH | ||
| FURA-2 dextran potassium salt, 10 000 MW | Invitrogen | F-3029 | Protect from light. |
| tetramethylrhodamine dextran 10 000 MW | Invitrogen | D-3312 | Protect from light. |
| n-eicosane | Sigma-Aldrich | 21, 927-4 | |
| Kwik Sil Adhesive | World Precision Instruments, Inc. | KWIK SIL | |
| Imaging Set-up | TILL Photonics | ||
| CCD camera | Imago | ||
| CED | Texas Instruments |
References
- Joerges, J., Küttner, A., Galizia, C. G., Menzel, R. Representations of odors and odor mixtures visualized in the honeybee brain. Nature. 387 (6630), 285-288 (1997).
- Rehder, V. Quantification of the honeybee's proboscis reflex by electromyiographic recordings. J. Insect Physiol. 33, 501-507 (1987).
- Galizia, C. G., Vetter, R. S. Optical Methods for Analyzing Odor-Evoked Activity in the Insect Brain. Methods in Insect Sensory Neuroscience. Christensen, T. A. , CRC Press. Boca Raton. 345-388 (2004).
- Mauelshagen, J. Neural correlates of olfactory learning paradigms in an identified neuron in the honeybee brain. J Neurophysiol. 69 (2), 609-625 (1993).
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- Bitterman, M. E., Menzel, R., Fietz, A., Schafer, S. Classical conditioning of proboscis extension in honeybees (Apis mellifera. Journal of Comparative Psychology. 97 (2), 107-119 (1983).
