Summary
Bijen kunnen worden geconditioneerd in een appetitief olfactorische leren paradigma (PER-conditioning). Het gebruik van geuren als prikkels, hebben we een methode waarin het gedrag wordt vastgelegd, terwijl tegelijkertijd Calcium Imaging wordt gebruikt om de geur oproept activiteit te meten in champignon lichaam neuronen
Abstract
De in vivo en semi-in vivo voorbereiding voor Calcium beeldvorming is ontwikkeld in ons laboratorium door Joerges, Kuttner en Galizia meer dan tien jaar geleden, aan geur opgeroepen activiteit te meten in de antennale lob 1. Vanaf dat moment is het voortdurend verfijnd en toegepast op verschillende neuropiles in de bij hersenen. We beschrijven hier de voorbereiding die momenteel worden gebruikt in het lab om de activiteit te meten in champignon lichaam neuronen met behulp van een dextran gekoppeld calcium-gevoelige kleurstof (Fura-2). We retrogradely vlek paddestoel lichaam neuronen door het injecteren van kleurstof in hun axonen of soma regio. Wij richten ons op het verminderen van de invasiviteit, om een voorbereiding waarin het nog steeds mogelijk om te trainen met behulp van de bij PER conditionering te bereiken. Wij zijn in staat om toezicht te houden en te kwantificeren de gedragsmatige respons door het opnemen van electro-myograms van de spier die de PER (M17) 2 controles.
Na de fysiologische experiment de verbeelde structuren worden onderzocht in meer detail met behulp van confocale scanning microscopie om de identiteit van de neuronen te pakken.
Protocol
Bee Voorbereiding en Back-fill
- Catch honingbij voedermachines bij bijenkorf en chillen op het ijs voor immobilisatie.
- Mount in plexiglas opname kamers 3. Fix ogen en thorax aan de wanden van de opname kamer met een laag smeltpunt harde was.
- Trek glazen capillairen zoals vaak gebruikt voor elektrofysiologie en breken bij de tip om een tip diameter van ca. verkrijgen. 10μm. Cover topje van de capillair met kleurstof pasta. Dye pasta bestaat uit een 10:01 mengsel van Fura-2 dextran en lysine altijd op de juiste tetramethylrodamine dextran.
- Voor de kleuringsprocedure immobiliseren antennes met kleinigheden of n-eicosane. Verwijderen van een stuk van cuticula boven de hersenen en duw klieren en de luchtpijp naar de zijkant om de toegang tot de paddestoel lichaam mogelijk te maken.
- Injecteer haarvaten in hetzij de soma of axonale gebied van paddestoelen lichaam neuronen. Dit kan gedaan worden de vrije hand of met behulp van een micro-manipulator. Vervolgens te herstellen cuticula stuk op het hoofd van capsule en draai antennes.
- Feed bijen met 30% sucrose-oplossing alvorens ze op te slaan in een vochtige geval voor ten minste vier uur of 's nachts bij 20 ° C.
In vivo beeldvorming
- Voorkom bewegingen van de bijen bijvoorbeeld met een klein stukje spons die wordt gedrukt tegen de buik en vastgezet met een clip of tape om de opname kamer.
- Om te voorkomen dat beweging van de hersenen als gevolg van het verpompen van de slokdarm, snijd een kleine incisie in de cuticula boven het labrum en trek de slokdarm en de omliggende solide structuren om het onder spanning zetten zonder beschadiging van de slokdarm 4. Dek af met twee componenten silicone.
- Maak gaten met een naald en steek draadelektroden voor de opname van M17.
- Verwijder de cuticula stuk, luchtpijp en klieren boven de hersenen. Zuigen heamolymph in het hoofd capsule met een stuk papier.
- Vul de kop capsule met twee componenten silicone. Het is belangrijk dat de hersenen volledig is bedekt.
- Plaats bij op het podium microscoop en plaats een druppel water op het oppervlak van de silicone om de dip doel van de microscoop onder te dompelen in de druppel. Focus op gekleurde neuronen.
Geur en registratie van signalen
Olfactometer: We maken gebruik van een computer gestuurde, custom built stimulatie-apparaat of "olfactometer", zoals eerder beschreven door Galizia en Vetter 3. Geuren worden verdund in een constante luchtstroom richting van de antennes. Elke stimulus bestaat uit een 3s geur puls van 0,2 ml geur verzadigde lucht. De stimulatie protocol kan worden ingesteld in de opname-software TILLVision.
Microscoop en Imaging set-up: We maken gebruik van een Zeiss fluorescentiemicroscoop. Beelden worden vastgelegd bij 25 ° C met een sampling-rate van 5 Hz met behulp van een TOT-Photonics beeldapparaat gemonteerd op de microscoop. Calcium signalen worden opgenomen via een X60, 0,9 W Olympus dip doelstelling met een Imago CCD camera (640x480 pixels, 4x weggegooid op de chip tot 160x120 pixels). Fura-2 is blij met monochromatisch licht van 380 nm golflengte 340 en voor ratiometrische metingen. Fluorescentie wordt gedetecteerd door middel van een 410nm dichroïde spiegel en een 440nm lange pass filter. De parameters voor de opname worden ingesteld in de opname-software. Elke meting duurt 10s en blootstelling tijd voor de twee golflengten kan worden aangepast aan de kleuring intensiteit in elk preparaat.
M17-opname: De gradenboog spieren van de labium (M17) is extracellulair opgenomen op de gedragsreacties die verband houden met het leren controleren, dat wil zeggen de PER 5, 6. Injecteer een koperdraad in de spier dicht bij de monddelen. Injecteer aardelektrode in het oog. De spier potentialen worden versterkt met een custom build voorversterker, gedigitaliseerd en opgeslagen op een computer. Stimulus ontstaan is veroorzaakt door de olfactometer.
Data Analysis
- Tijdens het experiment: De opnames van de calcium signaal worden ingevoerd in een computer en opgeslagen. De opname-software TILLVision maakt een eerste inspectie van de signalen, zoals de berekening van de verhouding tussen de golflengtes (340nm/380nm) en de berekening van de deltaF (aftrekken van de basis).
- Beeldverwerking wordt uitgevoerd met op maat geschreven programma's in IDL. Bereken ratio van Ca 2 + signalen van 340nm en 380 nm metingen voor elke pixel. Bepaal achtergrond fluorescentie (F) door gemiddeld meer dan frames voor de stimulus en aftrekken van de ratiometrische signaal (deltaF).
- Om Region of Interest (ROI) te definiëren: Bereken gemiddelde van frames tijdens de stimulus en breng een low pass filter (3X3px). Om te zetten grijsschaal om valse kleuren schaal. Bepaal activiteit in neuronale structuren als activiteit plekken in valse kleuren foto's en definiëren als ROI.
- Bereken temporele dynamiek van de actieve regio's door het gemiddelde van de pixels in de ROI over alle frames, zonder enige filtering of correctie.
Samen met de Fura-2 dextraan vullen we de neuronen met de Muur kleurstof rhodamine dextran ("mini Ruby"). Beide kleurstoffen hebben hetzelfde molecuulgewicht, ze moeten samen worden geplaatst in de neuronen. Wide-field imaging maakt slechts een zeer beperkte ruimtelijke resolutie, daarom is het aan te raden om de gekleurde structuren te onderzoeken na het experiment met behulp van confocale scanning microscopie.
- Na de fysiologische metingen, ontleden hersenen en fixeren.
- Spoel in PBS en stapsgewijze uitdrogen in ethanol en duidelijk in methyl salycilate.
- Voor de confocale microscopie embed hersenen in methyl salycilate.
- We maken gebruik van een Leica TCS SP2 microscoop. Excitatie golflengte is 543nm.
- We scannen de hersenen met een lucht-of olie-immersie objectief en vergelijk de gekleurde structuren met de beeldgegevens.
Representatieve resultaten:
Als de kleuring en de voorbereiding was succesvol, het signaal in valse kleuren schaal, bijvoorbeeld in champignon lichaam alfa-kwab extrinsieke neuronen, uit zou kunnen zien zoals in figuur 1.
De gedrags-respons (PER) kan worden berekend als piek frequentie tijdens de prikkel minus piek frequentie voor de stimulus (Figuur 2).
De gebrandschilderde structuren kunnen worden onderzocht in meer detail met behulp van een confocale microscoop (figuur 3).
Figuur 1: Vertegenwoordiger Calcium Imaging signalen (stimulatie met heptanal). A: Bedrukte regio van de honingbij hersenen. B: Raw fluorescerende beeld als gezien door een X20 dip doelstelling op 380 nm excitatie golflengte, is de alfa-lob van de paddestoel lichaam beschreven in het paars. Kleurstof werd geïnjecteerd in de ventro-laterale rand van de alfa-lobben aan extrinsieke neuronen vlek. C: valse kleuren afbeelding afgeleid van de gemiddelde signaal, deltaF (340/380), tijdens de drie seconden stimulus, alpha-kwab beschreven in het paars, geselecteerd ROI geschetst in het zwart. D: Temporele dynamieken van de calcium signaal in reactie op de geur stimulatie, gemiddelde signaal uit de regio van belang zoals aangegeven in C. E: Temporele dynamieken van de calcium signaal in reactie op de sucrose stimulatie van de ipsi-en contra-laterale antenne respectievelijk de ROI aangegeven in C.
Figuur 2: Representatieve M17 reactie. Na olfactorische conditionering van de bij een uitbreiding van de proboscis wanneer de geur wordt aangeboden zonder beloning. Rode lijn geeft geur stimulus. Inzet: PER van de honingbij.
Figuur 3: representatief beeld stack. Na de beeldvorming experiment van de hersenen werd ontleed. Het neuron uit figuur 1 is gescand met behulp van een confocale microscoop met een X20 olie-immersie objectief, alfa-lob die in paars.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze presentatie hebben we doorlopen alle stappen om te onderzoeken in vivo calcium signalen in de honingbij. We pasten deze techniek paddestoel lichaam neuronen, maar beeldvorming kan worden gedaan op alle neuronen waarvoor een kleuring techniek kan worden vastgesteld. Hebben we ons gericht op de neuronen in de olfactorische route van de honingbij. De experimenten zijn uitgevoerd in een donkere kamer. De set up is verlicht met een lange golf licht dat uit leugens van de optische waarneming bereik van de honingbij en niet prikkelen de kleurstoffen. Het is belangrijk om een tl-artefacten te vermijden, bijvoorbeeld luchtbellen in de siliconen.
Een van de grote voordelen van dit systeem is de mogelijkheid om informatie over de activiteit in neuronen met ruimtelijke en temporele resolutie monster. Op hetzelfde moment, kunnen we observeren de desbetreffende gedrag in de bij wanneer bijvoorbeeld leren in verband plasticiteit in neuronen dient te worden onderzocht. Echter, de ruimtelijke en temporele resolutie beperkt. Met behulp van in vivo beeldvorming calcium, is experimenteel tijd beperkt. Hoewel, met extracellulaire elektrofysiologische methoden, opnames kan duren voor enkele uren of dagen, zijn onze experimenten beperkt tot ongeveer 90 minuten. Signalen zijn nog steeds redelijk goed toen we voeren 85 metingen met excitatie door twee golflengten op een 5Hz sampling rate, elke meting duren 10 seconden, 340nm blootstelling wordt 20ms en 380 nm blootstelling blijvende 5ms, respectievelijk. Daarna bleken kleurstof kan een probleem worden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk wordt gefinancierd door de DFG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| low melting point hard wax Deiberit 502 | Dr. Böhme Schöps Dental GmbH | ||
| FURA-2 dextran potassium salt, 10 000 MW | Invitrogen | F-3029 | Protect from light. |
| tetramethylrhodamine dextran 10 000 MW | Invitrogen | D-3312 | Protect from light. |
| n-eicosane | Sigma-Aldrich | 21, 927-4 | |
| Kwik Sil Adhesive | World Precision Instruments, Inc. | KWIK SIL | |
| Imaging Set-up | TILL Photonics | ||
| CCD camera | Imago | ||
| CED | Texas Instruments |
References
- Joerges, J., Küttner, A., Galizia, C. G., Menzel, R. Representations of odors and odor mixtures visualized in the honeybee brain. Nature. 387 (6630), 285-288 (1997).
- Rehder, V. Quantification of the honeybee's proboscis reflex by electromyiographic recordings. J. Insect Physiol. 33, 501-507 (1987).
- Galizia, C. G., Vetter, R. S. Optical Methods for Analyzing Odor-Evoked Activity in the Insect Brain. Methods in Insect Sensory Neuroscience. Christensen, T. A. , CRC Press. Boca Raton. 345-388 (2004).
- Mauelshagen, J. Neural correlates of olfactory learning paradigms in an identified neuron in the honeybee brain. J Neurophysiol. 69 (2), 609-625 (1993).
- Kuwabara, M. Bildung des bedingten Reflexes von Pavlovs Typus bei der Honigbiene Apis mellifica, Hokaido Univ. Zool. J. Sci. 13, 458-464 (1957).
- Bitterman, M. E., Menzel, R., Fietz, A., Schafer, S. Classical conditioning of proboscis extension in honeybees (Apis mellifera. Journal of Comparative Psychology. 97 (2), 107-119 (1983).
