Summary
मधुमक्खियों का एक appetitive घ्राण सीखने प्रतिमान (प्रति कंडीशनिंग) में वातानुकूलित किया जा सकता है है. उत्तेजनाओं के रूप में odors के उपयोग, हम एक विधि है जो व्यवहार में दर्ज की गई है जबकि एक साथ कैल्शियम इमेजिंग मशरूम शरीर के न्यूरॉन्स में गंध पैदा गतिविधि को मापने के लिए प्रयोग किया जाता है की स्थापना की
Abstract
vivo और सेमीफाइनल में कैल्शियम इमेजिंग के लिए vivo तैयारी Joerges Küttner, और Galizia द्वारा हमारी प्रयोगशाला में विकसित किया गया है पर दस साल पहले, antennal 1 पालि में गंध पैदा गतिविधि को मापने के लिए. तब से यह लगातार परिष्कृत किया गया है और मधुमक्खी मस्तिष्क में अलग neuropiles के लिए लागू है. यहाँ, हम वर्तमान में प्रयोगशाला में प्रयोग किया जाता मशरूम शरीर dextran कैल्शियम के प्रति संवेदनशील डाई युग्मित (Fura-2) का उपयोग न्यूरॉन्स में गतिविधि को मापने की तैयारी का वर्णन. हम retrogradely उनके axons या सोम क्षेत्र में डाई के इंजेक्शन लगाने के द्वारा मशरूम शरीर न्यूरॉन्स दाग. हम invasiveness कम करने पर ध्यान केंद्रित करने के लिए एक तैयारी है जिसमें यह अभी भी संभव कंडीशनिंग प्रतिशत का उपयोग मधुमक्खी ट्रेन हासिल. हम निगरानी और मांसपेशियों जो प्रतिशत दो (M17) नियंत्रण से विद्युत myograms रिकॉर्डिंग से व्यवहार प्रतिक्रिया यों कर रहे हैं .
शारीरिक प्रयोग imaged संरचनाओं के बाद अधिक से अधिक confocal स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के लिए न्यूरॉन्स की पहचान का पता के विस्तार में जांच कर रहे हैं.
Protocol
बी तैयारी और वापस भरें
- हाइव और स्थिरीकरण के लिए बर्फ पर ठंड में शहद मधुमक्खी foragers पकड़ो.
- Plexiglas कक्षों 3 रिकॉर्डिंग में माउंट. कम पिघलने बिंदु हार्ड मोम के साथ रिकॉर्डिंग कक्ष की दीवारों के लिए आँखें और छाती ठीक.
- कांच capillaries के पुल के रूप में सामान्यतः इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए प्रयोग किया जाता है और टिप पर तोड़ने के लिए सीए के एक टिप व्यास प्राप्त. 10μm. कवर डाई पेस्ट के साथ केशिका की नोक. डाई पेस्ट Fura-2 dextran और lysine fixable tetramethylrhodamine dextran 10:01 मिश्रण के होते हैं.
- ज़रा सी बात या n-eicosane के साथ धुंधला हो जाना प्रक्रिया के लिए एंटीना स्थिर. मस्तिष्क के ऊपर छल्ली का एक टुकड़ा निकालें और पक्ष को ग्रंथियों और ट्रेकिआ धक्का मशरूम शरीर के लिए उपयोग की अनुमति.
- यह या तो सोम या मशरूम शरीर के न्यूरॉन्स की axonal क्षेत्र में capillaries इंजेक्षन. यह हाथ से मुक्त किया जा सकता है या एक माइक्रो जोड़तोड़ का उपयोग. फिर सिर कैप्सूल पर छल्ली टुकड़ा बहाल करने और एंटीना ढीला.
- एक humidified मामले में उन्हें कम से कम चार घंटे के लिए भंडारण से पहले या रात से अधिक 20 में 30% sucrose के समाधान के साथ मधुमक्खियों फ़ीड ° सी.
Vivo इमेजिंग में
- स्पंज का एक छोटा सा टुकड़ा है कि पेट के खिलाफ दबाया जाता है और एक क्लिप या कक्ष रिकॉर्डिंग के लिए टेप के साथ तय के साथ मधुमक्खी जैसे आंदोलनों को रोकें.
- घुटकी के पंप से उत्पन्न मस्तिष्क के आंदोलन को रोकने के के लिए, एक छोटा सा चीरा labrum ऊपर छल्ली में कटौती और बाहर ध्यान से घेघा खींच और उसके आसपास के ठोस संरचनाओं 4 घुटकी को नुकसान पहुँचाए बिना तनाव के तहत इसे डाल करने के लिए. दो घटक सिलिकॉन के साथ कवर.
- एक सुई के साथ छेद बनाओ और M17 की रिकॉर्डिंग के लिए तार इलेक्ट्रोड डालने.
- छल्ली टुकड़ा, ट्रेकिआ और मस्तिष्क के ऊपर ग्रंथियों निकालें. कागज के एक टुकड़े के साथ सिर कैप्सूल के अंदर heamolymph चूसो.
- दो घटक सिलिकॉन के साथ सिर कैप्सूल भरें. यह महत्वपूर्ण है कि मस्तिष्क पूरी तरह से कवर किया जाता है.
- खुर्दबीन मंच पर प्लेस मधुमक्खी और छोटी बूंद में डुबकी माइक्रोस्कोप के उद्देश्य विसर्जित करने के लिए सिलिकॉन की सतह पर पानी की एक बूंद जगह है. दाग न्यूरॉन्स पर ध्यान दें.
गंध और संकेत की उत्तेजना रिकॉर्डिंग
Olfactometer: हम एक कंप्यूटर नियंत्रित, कस्टम बनाया उत्तेजना डिवाइस या "olfactometer" Galizia और 3 वेई्रर द्वारा पहले वर्णित का उपयोग करें. Odors एक निरंतर हवा एंटीना की ओर निर्देशित धारा में पतला कर रहे हैं. कोई उत्तेजना 0.2ml गंध संतृप्त हवा के 3s गंध नाड़ी के होते हैं. उत्तेजना प्रोटोकॉल रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर TILLVision में सेट किया जा सकता है.
माइक्रोस्कोप और इमेजिंग सेट अप: हम एक Zeiss प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का उपयोग करें. छवियाँ 25 ° सी के साथ 5 हर्ट्ज के नमूने दर तक - फोटोनिक्स इमेजिंग खुर्दबीन पर घुड़सवार डिवाइस का उपयोग कर दर्ज कर रहे हैं. कैल्शियम संकेतों एक X60, 0.9 डब्ल्यू एक ईमागौ सीसीडी कैमरा (640x480 पिक्सेल, 160x120 पिक्सेल के लिए चिप पर binned 4X) के साथ डुबकी उद्देश्य ओलिंप के माध्यम से दर्ज कर रहे हैं. Fura 2 340 के रंग का प्रकाश और ratiometric मापन के लिए 380nm तरंगदैर्ध्य के साथ उत्साहित है. प्रतिदीप्ति एक 410nm dichroic दर्पण और एक 440nm लंबे समय से गुजारें फिल्टर के माध्यम से पता चला है. रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर में रिकॉर्डिंग के लिए पैरामीटर सेट कर रहे हैं. प्रत्येक माप रहता है 10s और दो तरंग दैर्ध्य के लिए जोखिम समय प्रत्येक तैयारी में धुंधला तीव्रता को समायोजित किया जा सकता है.
रिकॉर्डिंग M17: labium (M17) के चांदा मांसपेशियों extracellularly दर्ज की गई है व्यवहार सीखने के लिए संबंधित प्रतिक्रियाओं पर नजर रखने, प्रतिशत 5, 6 अर्थात्. मुँह भागों में करीब मांसपेशी में एक तांबे के तार सुई. आंख में जमीन इलेक्ट्रोड इंजेक्षन. मांसपेशियों की क्षमता एक कस्टम निर्माण पूर्व - प्रवर्धक के साथ परिलक्षित कर रहे हैं, digitalized और एक कंप्यूटर पर संग्रहीत. प्रोत्साहन शुरुआत olfactometer द्वारा ट्रिगर है.
डेटा विश्लेषण
- प्रयोग के दौरान: कैल्शियम संकेत के रिकॉर्डिंग एक कंप्यूटर में तंग आ चुके हैं और संग्रहीत. रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर TILLVision (340nm/380nm) तरंगदैर्य और deltaF (आधारभूत की घटाव) की गणना के बीच अनुपात की गणना की तरह संकेतों के एक प्रारंभिक निरीक्षण की अनुमति देता है.
- छवि प्रसंस्करण आईडीएल में कस्टम लिखा कार्यक्रमों के साथ किया जाता है. Ca 2 के अनुपात 340nm + संकेतों और प्रत्येक पिक्सेल के लिए 380nm माप की गणना . उत्तेजना से पहले फ्रेम औसत पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति (एफ) द्वारा निर्धारित और ratiometric संकेत (deltaF) से घटाना.
- ब्याज (आरओआई) के क्षेत्र को परिभाषित: उत्तेजना के दौरान फ्रेम के मतलब है और एक कम पास फिल्टर (3X3px) को लागू करने की गणना. झूठी रंग पैमाने पर करने के लिए ग्रे स्केल में कनवर्ट करें. झूठी रंग छवियों में गतिविधि के धब्बे के रूप में neuronal संरचनाओं में गतिविधि का निर्धारण और आरओआई के रूप में परिभाषित.
- किसी भी फ़िल्टरिंग या सुधार के बिना सभी तख्ते पर लागत पर लाभ में पिक्सल के औसत से सक्रिय क्षेत्रों के अस्थायी गतिशीलता गणना.
एक साथ dextran Fura-2 के साथ हम fixable डाई rhodamine dextran ("मिनी माणिक") के साथ न्यूरॉन्स को भरने. दोनों रंजक एक ही आणविक भार है, वे किया जाना चाहिए सह न्यूरॉन्स में स्थित है. वाइड क्षेत्र इमेजिंग केवल बहुत सीमित स्थानिक संकल्प की अनुमति देता है, इसलिए यह confocal स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी का उपयोग प्रयोग के बाद दाग संरचनाओं की जांच की सिफारिश की है.
- शारीरिक माप के बाद, दिमाग काटना और fixate.
- पीबीएस और इथेनॉल और मिथाइल salycilate में स्पष्ट में stepwise निर्जलीकरण में कुल्ला.
- Confocal माइक्रोस्कोपी के लिए मिथाइल salycilate मस्तिष्क में एम्बेड.
- हम एक Leica टीसीएस SP2 माइक्रोस्कोप का उपयोग करें. उत्तेजना तरंगदैर्ध्य 543nm है.
- हम एक हवा या तेल विसर्जन उद्देश्य के साथ मस्तिष्क स्कैन और इमेजिंग डेटा के साथ दाग संरचनाओं की तुलना.
प्रतिनिधि परिणाम:
यदि धुंधला हो जाना और तैयारी सफल रहा था, झूठी रंग के पैमाने में संकेत, मशरूम शरीर अल्फा पालि बाह्य न्यूरॉन्स में उदाहरण के लिए, संख्या 1 में तरह लग सकता है.
व्यवहार प्रतिक्रिया (प्रतिशत) उत्तेजना ऋण उत्तेजना (figure2) से पहले स्पाइक आवृत्ति के दौरान कील आवृत्ति के रूप में गणना की जा सकती है.
दाग संरचनाओं अधिक से अधिक एक confocal खुर्दबीन (figure3) का उपयोग कर विस्तार में जांच की जा सकती है.
चित्रा 1: प्रतिनिधि कैल्शियम इमेजिंग संकेतों (heptanal साथ उत्तेजना). एक: मधुमक्खी मस्तिष्क के imaged क्षेत्र. बी: कच्चा फ्लोरोसेंट छवि 380nm उत्तेजना तरंगदैर्ध्य पर एक डुबकी उद्देश्य X20 के माध्यम से देखा के रूप में, मशरूम शरीर के अल्फा - पालि बैंगनी में उल्लिखित है. डाई-अल्फा lobes के रिम ventro पार्श्व में इंजेक्ट किया गया था करने के लिए बाह्य न्यूरॉन्स दाग. सी: झूठी रंग छवि तीन दूसरा प्रोत्साहन के दौरान औसत संकेत, deltaF (340/380), से व्युत्पन्न, बैंगनी में उल्लिखित अल्फा - पालि, चयनित आरओआई काले में उल्लिखित है. डी: गंध उत्तेजना, ब्याज के क्षेत्र से औसत के संकेत के रूप में सी ई में संकेत के जवाब में कैल्शियम संकेत के टेम्पोरल गतिशीलता: sucrose उत्तेजना ipsi और विपरीत पार्श्व एंटीना के जवाब में कैल्शियम संकेत के टेम्पोरल गतिशीलता रॉय क्रमशः संकेत सी. में
चित्रा 2: प्रतिनिधि M17 प्रतिक्रिया. घ्राण कंडीशनिंग के बाद मधुमक्खी है जब गंध इनाम के बिना प्रस्तुत किया है सूंड फैली हुई है. लाल रेखा गंध उत्तेजना इंगित करता है. इनसेट: मधुप के प्रतिशत.
चित्रा 3: प्रतिनिधि छवि ढेर. इमेजिंग प्रयोग के बाद मस्तिष्क dissected था. संख्या 1 से न्यूरॉन एक X20 तेल विसर्जन उद्देश्य, बैंगनी में उल्लिखित अल्फा पालि के साथ एक confocal खुर्दबीन का उपयोग करने के लिए स्कैन है.
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Discussion
इस प्रस्तुति में हम सभी चरणों के माध्यम से चले गए मधुप में vivo कैल्शियम संकेतों में जांच करने के लिए. हम मशरूम शरीर के न्यूरॉन्स के लिए इस तकनीक लागू है, लेकिन इमेजिंग सभी न्यूरॉन्स, जो के लिए एक धुंधला तकनीक स्थापित किया जा सकता है पर किया जा सकता है. हम मधु मक्खी की घ्राण मार्ग में न्यूरॉन्स पर ध्यान केंद्रित किया है. प्रयोगों सब एक darkroom में प्रदर्शन कर रहे हैं. सेट अप एक लंबे लहर प्रकाश जो मधुमक्खी के ऑप्टिकल धारणा रेंज के बाहर झूठ और रंजक उत्तेजित नहीं के साथ प्रकाशित किया है. यह महत्वपूर्ण है किसी भी फ्लोरोसेंट कलाकृतियों उदाहरण के सिलिकॉन में हवाई बुलबुले के लिए, से बचने के.
इस प्रणाली का प्रमुख लाभ की संभावना के लिए स्थानिक और लौकिक संकल्प के साथ न्यूरॉन्स में गतिविधि के बारे में जानकारी नमूना है. उसी समय, हम मधुमक्खी में प्रासंगिक व्यवहार का निरीक्षण जब जैसे सीखने न्यूरॉन्स में संबंधित plasticity जांच की जानी है. हालांकि, स्थानिक और लौकिक संकल्प सीमित है. Vivo कैल्शियम इमेजिंग में का प्रयोग, प्रयोगात्मक समय सीमित है . कोशिकी electrophysiological तरीकों के साथ, जबकि रिकॉर्डिंग कई घंटे या दिन के लिए पिछले कर सकते हैं, हमारे प्रयोगों के बारे में 90 मिनट के लिए सीमित कर रहे हैं. सिग्नल अभी भी काफी अच्छा कर रहे हैं जब हम एक 5Hz नमूना दर, प्रत्येक माप स्थायी 10 सेकंड, 340nm 20ms और 380nm जोखिम स्थायी 5ms किया जा रहा जोखिम, क्रमशः में दो तरंगदैर्य द्वारा उत्तेजना के साथ 85 माप प्रदर्शन. बाद में एक समस्या बन सकता है विरंजन डाई.
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Acknowledgments
इस काम DFG के द्वारा वित्त पोषित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| low melting point hard wax Deiberit 502 | Dr. Böhme Schöps Dental GmbH | ||
| FURA-2 dextran potassium salt, 10 000 MW | Invitrogen | F-3029 | Protect from light. |
| tetramethylrhodamine dextran 10 000 MW | Invitrogen | D-3312 | Protect from light. |
| n-eicosane | Sigma-Aldrich | 21, 927-4 | |
| Kwik Sil Adhesive | World Precision Instruments, Inc. | KWIK SIL | |
| Imaging Set-up | TILL Photonics | ||
| CCD camera | Imago | ||
| CED | Texas Instruments |
References
- Joerges, J., Küttner, A., Galizia, C. G., Menzel, R. Representations of odors and odor mixtures visualized in the honeybee brain. Nature. 387 (6630), 285-288 (1997).
- Rehder, V. Quantification of the honeybee's proboscis reflex by electromyiographic recordings. J. Insect Physiol. 33, 501-507 (1987).
- Galizia, C. G., Vetter, R. S. Optical Methods for Analyzing Odor-Evoked Activity in the Insect Brain. Methods in Insect Sensory Neuroscience. Christensen, T. A. , CRC Press. Boca Raton. 345-388 (2004).
- Mauelshagen, J. Neural correlates of olfactory learning paradigms in an identified neuron in the honeybee brain. J Neurophysiol. 69 (2), 609-625 (1993).
- Kuwabara, M. Bildung des bedingten Reflexes von Pavlovs Typus bei der Honigbiene Apis mellifica, Hokaido Univ. Zool. J. Sci. 13, 458-464 (1957).
- Bitterman, M. E., Menzel, R., Fietz, A., Schafer, S. Classical conditioning of proboscis extension in honeybees (Apis mellifera. Journal of Comparative Psychology. 97 (2), 107-119 (1983).
