Summary
Bienen können in einer appetitive olfaktorischen Lernparadigma (PER-Konditionierung) konditioniert werden. Mit Gerüche als Stimuli, haben wir ein Verfahren, bei welchem Verhalten aufgezeichnet, während gleichzeitig Calcium Imaging wird verwendet, um Geruchs-evozierte Aktivität im Pilzkörper Neuronen zu messen ist
Abstract
Die in-vivo-und semi-in vivo Vorbereitung für Calcium Imaging hat in unserem Labor durch Joerges, Küttner und Galizia entwickelte vor über zehn Jahren, um Gerüche zu evozierte Aktivität im Antennallobus 1 zu messen. Von da an wurde kontinuierlich weiterentwickelt und an verschiedenen neuropiles in der Biene Gehirn. Hier beschreiben wir die Vorbereitungen derzeit im Labor verwendet werden, um Aktivität in Pilzkörper Neuronen mit einem Dextran gekoppelt Calcium-sensitiven Farbstoff (Fura-2) zu messen. Wir retrograd Fleck Pilzkörper Neuronen durch die Injektion von Farbstoff in ihre Axone oder soma Region. Wir konzentrieren uns auf die Verringerung der Invasivität zu konzentrieren, eine Vorbereitung, in denen es immer noch möglich, die Biene mit PER Klimaanlage Zug zu erreichen. Wir sind in der Lage zu überwachen und zu quantifizieren, die Verhaltensreaktion durch die Aufnahme elektro-myograms aus dem Muskel, die die PRO (M17) 2 steuert.
Nach dem physiologischen Experiment die abgebildeten Strukturen sind in größerem Detail mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie, die Identität der Neuronen-Adresse untersucht.
Protocol
Bee Vorbereitung und Zurück-fill
- Fangen Honigbiene Sammlerinnen bei hive-und Chill auf Eis Immobilisierung.
- Berg in Plexiglas Aufnahme Kammern 3. Fix Augen und Thorax an den Wänden der Aufnahme Kammer mit niedrigem Schmelzpunkt Hartwachs.
- Ziehen von Glaskapillaren als gewöhnlich für Elektrophysiologie und brechen an der Spitze zu einer Spitze Durchmesser von ca. erhalten. 10 um. Abdeckung Spitze der Kapillare mit Farbpaste. Dye Paste besteht aus einem 10:1-Gemisch von Fura-2 Dextran und Lysin feststellbar Tetramethylrhodamin Dextran.
- Für die Färbung immobilisieren Antennen mit Kleinigkeiten oder n-Eicosan. Nehmen Sie ein Stück Epidermis über dem Gehirn und schieben Drüsen und die Luftröhre zur Seite, um Zugang zu den Pilzkörper ermöglichen.
- Inject Kapillaren entweder in die Soma oder axonalen Region Pilzkörper Neuronen. Dies kann frei Hand oder mit einem Mikro-Manipulator. Dann wieder Nagelhaut Stück auf Kopfkapsel und lockern Antennen.
- Feed Bienen mit 30% Saccharose-Lösung vor dem Speichern in einem befeuchteten Fall für mindestens vier Stunden oder über Nacht bei 20 ° C.
In-vivo-Imaging
- Verhindern Bewegungen der Biene z. B. mit einem kleinen Stück Schwamm, der gegen den Bauch gedrückt und fixiert mit einem Clip oder Band, um die Aufnahme Kammer.
- Um zu verhindern, Bewegung des Gehirns, die sich aus Pumpen der Speiseröhre, schneiden einen kleinen Einschnitt in die Kutikula über dem Labrum und ziehen Sie vorsichtig die Speiseröhre und den umliegenden festen Strukturen, um es unter Spannung gesetzt, ohne die Speiseröhre 4. Deckel mit Zwei-Komponenten-Silikon.
- Machen Sie Löcher mit einer Nadel und stecken Drahtelektroden für die Aufnahme von M17.
- Entfernen Nagelhaut Stück, Luftröhre und Drüsen oberhalb des Gehirns. Saugen heamolymph im Kopf Kapsel mit einem Stück Papier.
- Füllen Sie den Kopf Kapsel mit Zwei-Komponenten-Silikon. Es ist wichtig, dass das Gehirn vollständig bedeckt ist.
- Legen Sie Biene auf Mikroskop-Bühne und geben Sie einen Tropfen von Wasser auf der Oberfläche des Silikons zu den Dip Objektiv des Mikroskops in den Tropfen eintauchen. Konzentrieren Sie sich auf gefärbte Neuronen.
Odor Stimulation und Aufzeichnung von Signalen
Olfaktometer: Wir verwenden einen Computer gesteuert, custom built Stimulationsgerät oder "Olfaktometer", wie zuvor von Galizia und Vetter 3 beschrieben. Gerüche werden in einen konstanten Luftstrom in Richtung der Antennen gerichtet verdünnt. Jeder Reiz besteht aus einem 3-Fettsäuren Geruch Puls von 0.2ml Geruch gesättigte Luft. Die Stimulation Protokoll kann in der Aufnahme-Software TILLVision eingestellt werden.
Mikroskop-und Imaging-Set-up: Wir verwenden ein Zeiss Fluoreszenzmikroskop. Die Bilder werden bei 25 ° C mit einer Sampling-Rate von 5 Hz mit einer TILL-Photonics Imaging-Gerät auf dem Mikroskop montiert aufgezeichnet. Calcium-Signale werden durch eine X60, 0,9 W Olympus dip Ziel mit einem Imago CCD-Kamera (640x480 Pixel, 4fach-on-Chip auf 160x120 Pixel Binning) aufgezeichnet. Fura-2 ist mit monochromatischem Licht von 340 und 380nm Wellenlänge für ratiometrische Messungen aufgeregt. Die Fluoreszenz wird durch einen 410 nm dichroitischen Spiegel und einem 440nm Langpassfilter erkannt. Die Parameter für die Aufnahme in die Aufnahme-Software eingestellt. Jede Messung dauert 10s und Belichtungszeit für die beiden Wellenlängen, die Intensität der Färbung in jedem Präparat eingestellt werden kann.
M17-Aufnahme: Die Winkelmesser Muskel des Labium (M17) extrazellulär ist es, die Verhaltensreaktionen in Bezug auf das Lernen Monitor aufgezeichnet, dh die PRO 5, 6. Inject einen Kupferdraht in den Muskel in der Nähe der Mundwerkzeuge. Inject Masseelektrode ins Auge. Der Muskel Potentiale werden mit einem benutzerdefinierten Build-Vorverstärker verstärkt, digitalisiert und gespeichert auf einem Computer. Beginn des Stimulus wird durch das Olfaktometer ausgelöst.
Data Analysis
- Während des Experiments: Die Aufnahmen der Calcium-Signal in einen Computer eingespeist und gespeichert werden. Die Aufnahme-Software ermöglicht TILLVision einer Erstprüfung der Signale, wie die Berechnung des Verhältnisses zwischen den Wellenlängen (340nm/380nm) und Berechnung von deltaf (Subtraktion des Ausgangswertes).
- Bildverarbeitung mit eigens geschriebenen Programmen in IDL durchgeführt. Berechnen Verhältnis von Ca 2 +-Signale von 340nm und 380nm Messungen für jedes Pixel. Bestimmen Sie Hintergrundfluoreszenz (F) durch Mittelung über Frames vor dem Reiz und subtrahieren von der ratiometrische Signal (deltaf).
- Um Region of Interest (ROI) zu definieren: Berechnen Sie Mittelwert von Frames während der Reiz und wenden Sie einen Tiefpassfilter (3X3px). Convert Graustufen auf false Farbskala. Bestimmen Aktivität in neuronalen Strukturen als Aktivität Spots in falsche Farbbilder und definieren als ROI.
- Berechnen Sie die zeitliche Dynamik der aktiven Bereiche durch Mittelung der Pixel in der ROI über alle Frames ohne Filterung oder Korrektur.
Zusammen mit der Fura-2 Dextran füllen wir die Neuronen mit den fixierbaren Farbstoff Rhodamin Dextran ("Mini-ruby"). Beide Farbstoffe haben das gleiche Molekulargewicht, sie sollten in den Neuronen co-lokalisiert werden. Weitwinkel-Bildgebung ermöglicht nur eine sehr begrenzte räumliche Auflösung, daher ist es empfehlenswert, die gefärbten Strukturen nach dem Experiment mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie zu untersuchen.
- Nach physiologische Messungen, sezieren Gehirn und zu fixieren.
- Spülen in PBS und schrittweise entwässern in Ethanol und klar in Methyl Salycilat.
- Für die konfokale Mikroskopie einbetten Gehirn in Methyl Salycilat.
- Wir verwenden ein Leica TCS SP2-Mikroskop. Anregungswellenlänge 543nm.
- Wir scannen das Gehirn mit einem Luft-oder Ölimmersionsobjektiv und vergleichen Sie die gefärbten Strukturen mit den Bilddaten.
Repräsentative Ergebnisse:
Wenn die Färbung und die Vorbereitung erfolgreich war, wird das Signal in falsche Farbskala, zum Beispiel in Pilzkörper alpha lobe extrinsischen Neuronen, könnte wie in Abbildung 1 aussehen.
Die Verhaltensreaktion (PER) als Spike-Frequenz während der Reiz minus Spikefrequenz vor dem Reiz (Abbildung 2) berechnet werden.
Die gefärbten Strukturen können in größerem Detail mit einem konfokalen Mikroskop (Abbildung 3) untersucht werden.
Abbildung 1: Repräsentative Calcium Imaging-Signale (Stimulation mit Heptanal). A: abgebildeten Bereich der Biene Gehirn. B: Raw Fluoreszenzbild wie durch ein X20 dip Ziel bei 380nm Anregungswellenlänge gesehen, ist die alpha-Lappen der Pilzkörper in lila dargestellt. Dye wurde in den ventro-lateralen Rand des alpha-Lappen injiziert, um extrinsische Neurone Fleck. C: Falschfarben-Bild aus dem durchschnittlichen Signal, deltaf (340/380), während die drei zweiten Reiz gewonnen; alpha-Lappen in lila dargestellt, erläutert ausgewählten ROI in schwarz. D: Zeitliche Dynamik der Kalzium-Signal in Reaktion auf Duftpuls, durchschnittliche Signal aus der Region von Interesse, da in C. E angegeben: Zeitliche Dynamik der Kalzium-Signal in Reaktion auf Saccharose Stimulation der ipsi-und kontralateralen Antenne bzw. der ROI angegeben in C.
Abbildung 2: Repräsentative M17 Reaktion. Nach olfaktorischen Konditionierung der Biene erweitert den Rüssel, wenn der Geruch ohne Belohnung wird vorgestellt. Rote Linie zeigt Geruch Reiz. Inset: PER der Honigbiene.
Abbildung 3: Repräsentative Bildstapel. Nach dem Imaging-Experiment wurde das Gehirn seziert. Das Neuron aus Abbildung 1 wird gescannt mit einem konfokalen Mikroskop mit einem X20 Ölimmersionsobjektiv, alpha-Lappen in lila dargestellt.
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Discussion
In dieser Präsentation haben wir alle Schritte gegangen, um in vivo Calcium-Signale in der Honigbiene zu untersuchen. Wir wandten diese Technik auf Pilzkörper Neuronen, sondern Bildgebung kann auf alle Neurone, für die eine Maltechnik hergestellt werden kann getan werden. Wir haben auf Neuronen im olfaktorischen Weg der Honigbiene konzentriert. Die Experimente sind in einer Dunkelkammer durchgeführt. Die Einrichtung ist mit einem langwelligen Licht, das aus Lügen der optischen Wahrnehmung Bereich der Biene und nicht erregt die Farbstoffe beleuchtet. Es ist wichtig, keine fluoreszierenden Artefakte zu vermeiden, zum Beispiel Luftblasen im Silikon.
Einer der größten Vorteile dieses Systems ist die Möglichkeit, Informationen über die Aktivität in Neuronen mit räumlicher und zeitlicher Auflösung Probe. Zur gleichen Zeit, können wir unter Beachtung der einschlägigen Verhaltens in der Biene, wenn z. B. das Lernen im Zusammenhang Plastizität in Neuronen untersucht werden soll. Allerdings ist die räumliche und zeitliche Auflösung begrenzt. Mit in vivo Calcium Imaging, ist experimentell zeitlich begrenzt. Während bei extrazellulären elektrophysiologischen Methoden, Aufnahmen für mehrere Stunden oder Tage dauern kann, sind unsere Versuche bis etwa 90 Minuten begrenzt. Die Signale sind immer noch recht gut, wenn wir 85 Messungen bei Anregung durch zwei Wellenlängen in einem 5Hz Abtastrate, jede Messung dauert 10 Sekunden, 340nm Exposition zu 20ms und 380nm Exposition dauerhafte 5ms bzw. durchzuführen. Danach Farbbleichung kann ein Problem werden.
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Acknowledgments
Diese Arbeit wird von der DFG gefördert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| low melting point hard wax Deiberit 502 | Dr. Böhme Schöps Dental GmbH | ||
| FURA-2 dextran potassium salt, 10 000 MW | Invitrogen | F-3029 | Protect from light. |
| tetramethylrhodamine dextran 10 000 MW | Invitrogen | D-3312 | Protect from light. |
| n-eicosane | Sigma-Aldrich | 21, 927-4 | |
| Kwik Sil Adhesive | World Precision Instruments, Inc. | KWIK SIL | |
| Imaging Set-up | TILL Photonics | ||
| CCD camera | Imago | ||
| CED | Texas Instruments |
References
- Joerges, J., Küttner, A., Galizia, C. G., Menzel, R. Representations of odors and odor mixtures visualized in the honeybee brain. Nature. 387 (6630), 285-288 (1997).
- Rehder, V. Quantification of the honeybee's proboscis reflex by electromyiographic recordings. J. Insect Physiol. 33, 501-507 (1987).
- Galizia, C. G., Vetter, R. S. Optical Methods for Analyzing Odor-Evoked Activity in the Insect Brain. Methods in Insect Sensory Neuroscience. Christensen, T. A. , CRC Press. Boca Raton. 345-388 (2004).
- Mauelshagen, J. Neural correlates of olfactory learning paradigms in an identified neuron in the honeybee brain. J Neurophysiol. 69 (2), 609-625 (1993).
- Kuwabara, M. Bildung des bedingten Reflexes von Pavlovs Typus bei der Honigbiene Apis mellifica, Hokaido Univ. Zool. J. Sci. 13, 458-464 (1957).
- Bitterman, M. E., Menzel, R., Fietz, A., Schafer, S. Classical conditioning of proboscis extension in honeybees (Apis mellifera. Journal of Comparative Psychology. 97 (2), 107-119 (1983).
