Vorbereitung der Aplysia Sensory-Motor neuronalen Zellkulturen

Summary

Primäre Kulturen von

Abstract

Das Nervensystem der Meeresschnecke Aplysia californica ist relativ einfach, bestehend aus etwa 20.000 Neuronen. Die Neuronen sind groß (bis zu 1 mm im Durchmesser) und identifizierbar sind, mit unterschiedlichen Größen, Formen, Positionen und Pigmentierungen, und die Zellkörper nach außen in fünf gepaart Ganglien im ganzen Körper des Tieres verteilt ausgesetzt. Diese Eigenschaften haben die Forscher um die Schaltung zugrunde liegenden spezifischen Verhaltensweisen in der Tier ¹ abzugrenzen erlaubt. Die monosynaptische Verbindung zwischen sensorischen und motorischen Neuronen ist ein zentraler Bestandteil der Kiemenrückziehreflex in das Tier, eine einfache Abwehrreflex in dem das Tier zieht ihren Kiemen in Reaktion auf taktile Stimulation des Siphons. Dieser Reflex erfährt Formen des nicht-assoziativen und assoziativen Lernens, einschließlich der Sensibilisierung, Gewöhnung und klassische Konditionierung. Von besonderem Nutzen für das Studium der synaptischen Plastizität kann der sensorisch-motorischen Synapse in der Kultur wieder hergestellt werden, wo gut charakterisierten Reize zu entlocken Formen der Plastizität, die direkt korreliert in das Verhalten des Tieres ^2,3 haben. Speziell erzeugt Anwendung von Serotonin eine synaptische Verstärkung, dass, abhängig von der Anwendung Protokoll, dauert Minuten (kurzfristige Erleichterung), Stunden (mittelfristige Erleichterung) oder Tagen (langfristige Erleichterung). Im Gegensatz dazu erzeugt die Anwendung der Peptid-Sender FMRFamid eine synaptische Schwächung oder Depression, die, abhängig von der Anwendung Protokoll von Minuten bis Tage (long-term depression) dauern kann. Die Größe der Neuronen ermöglicht wiederholte scharfe Elektrode Aufnahme der synaptischen Erregung über Zeiträume von Tagen zusammen mit Mikroinjektion von Expressionsvektoren, siRNAs und andere Verbindungen auf spezifische Signalwege und Moleküle Ziel und damit die molekularen und zellbiologischen Schritte, die Änderungen unterliegen in der synaptischen Effizienz.

Ein weiterer Vorteil der Aplysia Kultur-System kommt von der Tatsache, dass die Neuronen Synapsen-Spezifität zeigen, in der Kultur ^4,5. So müssen sensorischen Neuronen nicht bilden Synapsen mit sich selbst (autapses) oder mit anderen sensorischen Neuronen, noch bilden sie Synapsen mit Nicht-Zielorganismen identifiziert Motoneuronen in der Kultur. Die Krampfadern, Stätten der synaptischen Kontakte zwischen sensorischen und motorischen Neuronen, sind groß genug (2-7 Mikrometer im Durchmesser), damit Synapsenbildung (sowie Veränderungen der synaptischen Morphologie) mit Ziel-Motoneuronen auf das Licht mikroskopischer Ebene untersucht werden.

In diesem Video zeigen wir jeden Schritt der Herstellung sensorisch-motorischen Neurons Kulturen, einschließlich Anästhesie erwachsenen und jugendlichen Aplysia, sezieren ihre Ganglien, Proteaseverdau der Ganglien, die Entfernung des Bindegewebes durch Mikrodissektion, Identifizierung der beiden sensorischen und motorischen Neuronen und Entfernung jeder Zelltyp durch Mikrodissektion, dem Plattieren der Motoneuronen, neben der sensorischen Neuronen und Manipulation der sensorischen Neuriten Kontakt mit dem kultivierten Motoneuronen bilden.

Protocol

Vorbereitung (siehe Lösungen Abschnitt am Ende des Protokolls für die Zusammensetzung von Lösungen)

1. Bereiten Kulturschalen. Beschichtung von Glas und von Mattek Glasboden-Kulturschale mit Poly-L-Lysin (made in Natriumborat). Add genug, um vollständig zu bedecken das Glas gut und lassen für> 1 Std. (über Nacht bleiben). Gründlich von Poly-L-Lysin durch Spülen in künstlichem Meerwasser (ASW) 4-5 mal. Nach dem Entfernen der letzten Spülgang, fügen Sie 2 ml 50% L15 (ergänzt mit Salzen und mit L-Glutamin in einer Endkonzentration von 2 mM) / 50% Hämolymphe. Das Kulturmedium muss in Schale für mindestens eine Stunde vor dem Beschichten Zellen, so dass die Hämolymphe Schichten der Schale.
2. Reinigen Sie die Werkzeuge und Sylgard Gerichte mit Ethanol, spülen Sie sie gründlich mit ddH ₂ 0 und sie dann für> 1 h unter UV-Licht in die Kultur Kapuze.
3. Bereiten scharfen Elektroden für die Mikrodissektion von Neuronen. Mit einer Mikroelektrode Abzieher (z. B. Sutter Flaming Brown P-97), ziehen Glaspipette Elektroden mit 1,5 mm Außendurchmesser, 0,86 bis 1,12 mm Innendurchmesser und 100 mm Länge (z. B. AM-System Katalog # 628000; World Precision Instruments TW150-4, 1,55 / 1,12). Verwenden Sie Parameter, die eine Elektrode herzustellen mit einer langen und wispy feine Spitze eines solchen hohen Widerstand, dass es keine Kapillare Aufnahme von Flüssigkeit, wenn sie in Lösung gebracht. Die Anwesenheit einer Flüssigkeit Meniskus bedeutet, dass die Spitze der Elektrode wird Neuron während der Isolierung beschädigt werden. Die Sutter-Elektrode Kochbuch bietet eine hervorragende Richtlinien zum Einrichten Elektrode Programme. Wir verwenden ein Feld Filament, und in einem Schritt zu ziehen, um Kultur-Elektroden zu erzeugen.
4. Bereiten Anästhesie-Lösung (0,35 M MgCl2), Kulturmedium (L15 ergänzt mit Salzen und Hämolymphe) und Protease-Lösung (1% Protease Typ IX, Sigma, 1 Einheit / mg, bis zu einer Endkonzentration von 10 Einheiten / ml).
5. Tiere: Nutzung Erwachsenen 80-100 g Aplysia zur Isolierung von sensorischen Neuronen und der LFS Motoneuronen. Verwenden Sie juvenile 1-4 g Aplysia zur Isolierung von L7 Motoneuronen. Entfernen Sie die Tiere vorsichtig aus dem Meerwasserbecken und pflegen in Meerwasser (im Becher, Eimer oder Beutel) für nicht mehr als 30 Minuten vor Beginn der Narkose und Kultur Verfahren.

Kultur Verfahren

A. Kultivierung Pleural sensorischen Neuronen von 80 bis 100 g Aplysia

1. Anesthetize die Tiere für die Entfernung von Ganglien: Inject 0,35 M MgCl ₂ zu erwachsenen Aplysia (80-100 g) mit einer 60 ml Spritze mit einer 18-Gauge-Nadel 1,5 Zoll. Geben Sie den Fuß des Tieres in einem Winkel von etwa 35 Grad, und nicht zu tief ein. Das Ziel ist, in die hemocoel des Tieres ohne Durchdringung der inneren Organe zu injizieren. Das Tier sollte sich sehr aufgetrieben und entspannt.
2. Präparieren Sie die Ganglien: Pin am narkotisierten Tier auf dem Seziertisch Schale, mit einem Stift (18-Gauge-Nadeln eignen sich gut für 80-100 g Tiere) an der Spitze und der Schwanz, und der Fuß nach oben zeigt. Halten Sie den Fuß mit einem gezahnten Pinzette und Durchtrennung der Haut und des darunterliegenden Bindegewebes die volle Länge des Fußes (von Kopf bis Schwanz) mit einer chirurgischen Schere. Pin beiden Seiten nach unten. Mit einer Pinzette und Schere, schnitt der Speiseröhre und ziehen Sie zur Seite, um die Ganglien aussetzen. Mit einer feinen Pinzette und einer feinen Schere, schneiden Sie die Pleura Pedalganglien (die sensorischen Neuronen im Pleuralganglien). Lassen Sie eine angemessene Menge Nerven, da dies macht es einfacher, festzunageln die Ganglien nach Protease-Behandlung.
3. Proteaseverdau Ganglien: Legen Sie die Ganglien in Protease-Lösung (10 mg / ml von 1 Einheit / mg in L15) in einem Inkubator eingestellt auf 34,5 ° C (34-35 ° C ist okay) für 2 Stunden und 15 Minuten. Mit der feinen Spitze einer Pinzette zu übertragen und waschen Sie die Ganglien in ASW dreimal. Halten Sie die Ganglien in L15. Beachten Sie, dass die Protease Inkubationszeit kann variieren. Der Zweck ist es, das Bindegewebe zu leicht entfernt werden. Wenn es zu schwierig desheath die Ganglien ohne Beschädigung der Neuronen ist, erhöhen Sie die Protease Inkubationszeit. Wenn es extrem einfach zu desheath ist die Ganglien und der Neuronen sind "weiche", reduzieren die Protease Inkubationszeit.
4. Desheathing die Ganglien: Transfer der Protease verdaut Ganglien zu einer 60 mm oder 35 mm Schale mit Sylgard und L15. Profil unter einem Stereomikroskop (mit externen Halogenbeleuchtung), zu entfernen Pedalganglien und Stift auf der Pleuralganglien in der Sylgard Gericht in der richtigen Orientierung mit Insekten Pins und einer feinen Pinzette. Mit dem feinen Pinzette und eine Vanna chirurgische Scheren, heben das Bindegewebe und schneiden Sie es auf die sensorische Cluster aussetzen. Achten Sie darauf, jemals zu berühren oder Schäden der neuronalen Somata. Entfernen Sie überschüssiges Bindegewebe aus der Schüssel und fügen Sie mehr Medium, achten Sie darauf, niemals aussetzen desheathed Ganglion in die Luft. Die sensorische Cluster besteht aus rund 200 Cluster-Neuronen von 40-50 Mikrometer Durchmesser. Setzen Sie einen Stift zu einer "post" in kurzer Entfernung machen aus dem GanglIon (im Blickfeld).
5. Isolation von Neuronen: Die Verwendung von langen, scharfen Glas Kultur Elektrode, ziehen Sie die identifizierten Neuronen eins nach dem anderen durch Berühren der Zellkörper nur aus der Mitte (nicht durchbohren) und langsam und stetig zieht die Zelle soma, zusammen mit dem Axon, weg von der Ganglion. Vorsichtig gegen den Stift tippen, um die Neuronen von der Elektrode zu entfernen.
6. Plating Neuronen: Verwenden Sie eine Pipetman (P10) zu einzelnen Neuronen aus dem Sylgard Gericht zu übertragen, um eine Kulturschale. Vor der Übertragung der Neuronen, pipet Kulturmedium in die Spitze, so dass die Spitze aus Kunststoff mit Hämolymphe beschichtet ist (dies verhindert, dass die Neuronen Ankleben an der Plastik). Achten Sie vor allem vermeiden, dass die Neuronen, um mögliche Luftblasen oder einen extremen Kräften (dh sehr vorsichtig aufnehmen und entfernen Sie die Neuronen aus dem pipetteman). Verteilen Sie die Neuronen gleichmäßig über die Schüssel. Mit einem scharfen Elektrode vorsichtig und gerade die Prozesse, und tippen Sie sie nach unten.
7. Inkubation: Lassen Sie die Gerichte auf Mikroskoptisch bei Raumtemperatur nicht weniger als 3 Stunden. Wir routinemäßig lassen Sie sie über Nacht. Stellen Sie sicher, dass der Mikroskoptisch während dieser Zeit ist unbeirrt. Decken Sie die Bühne mit Aluminiumfolie vor Licht zu schützen. Gently übertragen Sie sie auf einem 18 ° C Inkubator.
8. Kulturen sollte das Gericht innerhalb von ca. 3 Stunden halten und neue Neuritenwachstum sollte innerhalb etwa 6-12 Stunden sichtbar. Das Wachstum der isolierten sensorischen Neuronen ein Plateau erreicht, von DIV 3 oder 4. Beachten Sie, dass isolierte sensorischen Neuronen doe nicht bilden autapses oder chemische Synapsen miteinander, obwohl sie bilden elektrische Gap Junctions zu tun.

B. Herstellung von sensorischen Neuronen-Motoneuronen Kokulturen

Sensorische Neuronen bilden Synapsen mit Ziel-Motoneuronen in der Kultur. Die am häufigsten verwendeten motorischen Neuronen sind die LFS Motoneuronen und die L7-Motor Neuron, von der Abdominalganglion. Die LFS Motoneuronen sind von Erwachsenen (80-100 g) Aplysia isoliert, und es gibt ca. 20 LFS Motoneuronen pro Abdominalganglion. Der L7-Motor Neuron ist aus juvenile (1-4 g) Tieren isoliert, und es gibt nur eine L7 pro Bauchganglien. LFS Motoneuronen sind 40-50 Mikrometer im Durchmesser, gehören zu den LE sensorischen Neuronen in der Nähe der Wurzel des Siphons Nerven auf der ventralen Oberfläche des Bauchganglien durchsetzt, und zeichnen sich durch eine subtile dunkles Pigment vor Ort in jedem Soma aus. Das L7 Motoneuronen: 100-150 Mikrometer im Durchmesser und ist auf der dorsalen Oberfläche des Ganglion, auf der mittleren Rand der linken Seite des Ganglion. Zwar ist es wirtschaftlicher, LFS Motoneuronen verwendet wird, ist die Größe des L7 Motoneuronen vorteilhaft für einige Experimente. Die L11 Motoneuronen, auch auf der dorsalen linken Oberfläche des Abdominalganglion, kaudal L7, ist ein Nichtziel Motoneuronen und kann effektiv als Kontrolle, mit der die sensorischen Neuronen fasciculates bildet aber keine chemische Synapsen verwendet werden.

1. Anesthetize die Tiere für die Entfernung von Ganglien. Für LFS Motoneuronen, tun, was für pleurale sensorischen Neuronen beschrieben. Für L7 Motoneuronen, injizieren 0,35 M MgCl ₂ in juvenile Aplysia (1-4 g) mit einer 10 ml Spritze mit einer 21-Gauge-Nadel.
2. Präparieren Sie die Bauchganglien: Pin am narkotisierten Tier auf dem Seziertisch Gericht wie oben (mit 21-Gauge-Nadeln für Jungtiere) beschrieben. Mit einer feinen Pinzette und einer feinen Schere, schneiden Sie die Bauchganglien.
3. Proteaseverdau Ganglien: Dies geschieht, wie bei Pleura-sensorischen Neuronen beschrieben, außer dass die Verdauung Zeit zu 1 Std. 45 Min. für Ganglien aus juvenile (1-4 g) Tiere reduziert wird.
4. Desheathing die Ganglien: Transfer der Protease verdaut Ganglien zu einer 35 oder 60 mm Schale mit Sylgard und L15. Profil unter einem Stereomikroskop (mit externen Halogenbeleuchtung), in den Ganglien, die in der Sylgard Gericht in der richtigen Orientierung mit Insekten Pins und einer feinen Pinzette. Mit dem feinen Pinzette und eine Vanna chirurgische Scheren, heben das Bindegewebe und schneiden Sie es auf die neuronalen Zellkörpern aussetzen. Zur Isolierung der LFS Motoneuronen, pin das Ganglion, so dass die Bauchseite nach oben zeigt, und mit einer Zange ziehen Sie die Bindegewebe zurück auf die gesamte Hälfte des Ganglion mit dem LFS Motoneuronen (rechts), desheath das Expose übrigen Teile des Ganglion entfernen Bindegewebe aus der Schüssel und fügen Sie mehr L15. Zur Isolierung des L7 oder L11 Motor Neuron, pin das Ganglion, so dass die dorsale Oberfläche nach oben zeigt, und mit einer Zange ziehen Sie die Bindegewebe zurück auf die Hälfte des Ganglion, die sowohl L7 und L11 (links) aussetzen. Achten Sie darauf, jemals zu berühren oder Schäden der neuronalen Somata. Legen Sie einen Stift zu einer "post" in kurzer Entfernung vom Ganglion (innerhalb des field of view) zu machen.
5. Isolation von Neuronen: Entfernen Neuronen mit einem scharfen Elektrode für die sensorischen Neuronen beschrieben. Die LFS Neuronen differentiated aus dem benachbarten LE sensorischen Neuronen auf der Grundlage eines kleinen dunklen Pigmentflecken in ihrer Somata. Das L7 Neuron kann von der L11 Neuron ersten differenzierten werden, da die L11 ist kaudal L7, weil die L11 Zellkörper ist mehr länglicher Form, während die L7 Zellkörper ist runder und weil die L11 Axon neigt dazu, verzweigen sich in zwei nahe an die Zelle Körper.
6. Plating Neuronen: Verwenden Sie eine Pipetman (P10) zu einzelnen Neuronen aus dem Sylgard Gericht zu übertragen, um eine Kulturschale für die sensorischen Neuronen beschrieben.
7. Pairing mit sensorischen Neuronen: Lassen Sie die Motoneuronen der Kulturschale haften für mindestens 1 Stunde. Dann fügen Sie die isolierten sensorischen Neuronen mit einem Pipetman, liefert jeder sensorischen Neuronen benachbart zu einem plated motorischen Neurons. Mit einem scharfen Glaselektrode vorsichtig strecken die sensorischen Neuron Axon, und Koax die sensorischen Zellkörper in eine Position neben dem Motor Neuron, in einem Abstand gleich oder etwas kleiner als die Länge der sensorischen Zelle Axon. Mit der Glaselektrode, Koax die sensorischen Axon in Kontakt mit den Motoneuronen kommen, sehr vorsichtig mit der Seite des konischen Elektrode, endlich die sensorischen Axon physisch an das Axon des motorischen Neurons. Heben Sie nicht der Kulturschale, sondern sanft gleiten die Schüssel auf dem Mikroskoptisch.
8. Lassen Sie die Gerichte auf Mikroskoptisch bei Raumtemperatur nicht weniger als 3 Stunden und Überweisung auf ein 18 ° C Inkubator für die sensorische Neuronen beschrieben.
9. Kulturen sollte das Gericht innerhalb von ca. 3 Stunden halten und neue Neuritenwachstum sollte innerhalb etwa 6-12 Stunden sichtbar. Sensorische Neuronen bilden glutamatergen Synapsen mit Motoneuronen sehr schnell - so schnell wie die Zelle anhaftenden genug, um scharfe Elektrode Aufnahme (3-5 Stunden), eine exzitatorische postsynaptische Potential aufgezeichnet werden durchführen können. Synaptischer Verbindungen weiter, bis DIV 3 zu erhöhen, und ist dann bis DIV7 stabil. Die Neuronen sollten aufwendige Neuritenwachstum in den ersten 1-3 Tagen in Kultur zu zeigen.

C. Herstellung der Hämolymphe

Hämolymphe ist als Wachstumsfaktor in Aplysia Kultur (analog zu der Verwendung von fötalem Kälberserum in Säugetier-Zellkultur) verwendet. Es ist von großen (500 g-1 kg) Tiere gesammelt und die beste Zeit, um Hämolymphe zu sammeln (anekdotisch) ist im Frühjahr (Mitte März bis Juni). Wickeln Sie das Tier in einem Einweg-underpad, so dass nur ein kleiner Teil des Tieres ausgesetzt ist, sauber, dass Teil der Haut mit Ethanol und dann halten, während eine andere Person verwendet eine sterile Rasierklinge einen Schnitt in der exponierten Bereich zu machen. Squeeze das Tier so, dass die Hämolymphe spritzt in ein sauberes Becherglas, um sicherzustellen, dass es nicht in Kontakt mit den schmutzigen Haut des Tieres. Die Hämolymphe füllt die hemocoel des Tieres (dh, das Tier ist im Grunde ein sac von Hämolymphe). Rewrap das Tier ein-oder zweimal, um einen neuen Schnitt und drücken schwer, so viel Hämolymphe wie möglich zu sammeln (sammeln in einem neuen Becher so, dass, wenn es verschmutzt ist, ist die erste Kollektion noch brauchbar). Hämolymphe von jedem Tier sollten getrennt gehalten werden (dh nicht-Pool Hämolymphe von verschiedenen Tieren). Spin der Hämolymphe bei 2000 xg für 10 min bis Blutkörperchen zu entfernen. Aliquot des Überstandes in 10 ml Aliquots Label von Tier-und bei -80 ° C. Beachten Sie, dass Hämolymphe bei -20 ° C gelagert bildet sich ein Niederschlag in Medium. Ein neues Aliquot Hämolymphe verwendet jedes Mal Kulturmedium hergestellt wird, und die aliquoten sind unmittelbar vor der Herstellung des Mediums aufgetaut werden. Nicht wieder einfrieren nach dem Auftauen.

Discussion

Die erfolgreiche Herstellung von Aplysia sensomotorische Kulturen hat eine etwas langsame Lernkurve, da es die Entwicklung der Feinmotorik mit Mikrodissektion und Manipulation einzelner Nervenzellen über ein Stereo-Mikroskop betrachtet verbundenen beinhaltet. Nach unserer Erfahrung dauert es ca. 1-3 Wochen Praxis zu gesunden isolierten sensorischen Neuronen in Kultur und eine zusätzliche 1-3 Wochen erhalten zu lernen, wie sensorische Neuronen mit motorischen Neuronen Paar. Wir routinemäßig vorzubereiten Kulturen in einer Labconco Clean Bench, obwohl es möglich ist, sie auf jeden Labortisch oder Schreibtisch vorbereiten, solange das Mikroskop während der Kultivierung (keine Vibrationen oder mechanische Störungen verhindern, dass die Neuronen von anhaftenden) ist beunruhigt. Da die Neuronen im Meerwasser wachsen bei 18 ° C, bakterielle und pilzliche Kontaminationen sind deutlich weniger verbreitet als in Säugerzellen. Die wichtigste Variable in Kultur Vorbereitung ist die Qualität des Tieres. Aplysia kann entweder von Anbietern, die sie sammeln, direkt aus dem Pazifischen Ozean (Alacrity oder Marinus), oder von der University of Miami Mariculture Anlage, die Brutpaare sammelt erworben werden aus dem Pazifik und wächst dann Aplysia durch einen Fortpflanzungszyklus. Als solche sind die Tiere genetisch heterogen, und im Falle der Tiere aus dem Meer gesammelt, sie sind auch im Hinblick auf ihre Umwelt Geschichte heterogen. Es gibt einige Saisonalität der Qualität der Neuronen aus Aplysia erhalten, wobei die schlimmste Zeit in der Regel auftretende im August, und ein anderer geringerer Qualität Zeitraum rund Dezember. Eine weitere wichtige Variable ist die Hämolymphe. Es ist ratsam, verschiedene Chargen von Hämolymphe für ihre wachstumsfördernde Fähigkeit zu testen und die gleiche Charge von Hämolymphe für eine Reihe von Experimenten verwenden.

Trotz der Schwierigkeit der Herstellung Aplysia neuronalen Kulturen, sie besitzen eine Reihe von einzigartigen und wertvollen Vorteile der Studie der Synapsenbildung und synaptische Plastizität. Sie bilden monosynaptische Verbindungen in Kultur, die durch scharfe Elektrode Aufnahme für einen Zeitraum von Tagen überwacht werden kann. Gut charakterisierte Protokolle existieren, die zu entlocken Formen der Plastizität, die deutliche Parallelen im Verhalten des Tieres haben. Stimuli kann die Badewanne oder auf Teilmengen von synapses6, 7 angewendet werden, und die Geometrie der Kulturen kann variiert werden, so dass man sensorischen Neurons in Kontakt mit einer einzigen Motor Neuron oder einer sensorischen Nervenzelle mit einem gegabelten Axon Kontakte zwei Motor-Neuronen, oder zwei sensorische Neuronen an einen einzelnen motorischen Neurons. Molekular-und zellbiologische Wege können in einzelnen Neuronen durch Mikroinjektion von DNA, RNA, siRNA und andere Reagenzien verändert werden, und die Effekte auf die neuronale Struktur und Funktion, synaptischen Übertragung und Plastizität kann mit zeitlicher und räumlicher Auflösung beobachtet werden. Die NIH und Broad Institute stehen vor dem Abschluss der Sequenzierung des Genoms Aplysia, die sollten

Materials

Solutions needed for culture 0.35 M MgCl2, stored at room temperature, used for anesthesia. Poly-L-lysine solution, Sigma: P-1524, MW >300,000, made in 0.1M Sodium Borate pH8.2 to 0.5mg/ml solution. Vortex well and filter sterilize through a 0.22 μm filter, store it at 4C°. Do not freeze-thaw. L-15 Medium powder (Leibovitz) (Sigma: L4386) supplemented with the salts as below to make 1 liter L-15 powder 13.8g NaCl 15.4 g D-Glucose 6.24 g MgSO4•7H20 6.45g KCl 350 mg NaHCO3 170 mg MgCl2•6H2O 5.49 g CaCl2•2H2O 1.43g HEPES 3.53g Add ddH20 to 1 liter. The pH should be about 7.4-7.5, add 10ml of 100X Pen/Strep solution, and filter-sterilize through a 0.22 μm filter. Store at 4C0 for no longer than 1 month. Protease digestion solution: 1% Protease IX (1unit/mg) is made in L15 (supplemented with salts as above) or in ASW immediately before use, filter-sterilized through a 0.22 μm Millipore. 5mls should be enough for the ganglia from two animals (make sure the ganglia are completely immersed in protease solution). Sigma has reported that they will discontinue selling Protease IX. A substitute protease is: Dispase II (Roche Applied Science catalog # 04942078001). Culture medium. Immediately prior to preparing cultures, thaw a 10 ml aliquot of hemolymph and mix it with 10 mls of L15 (supplemented with salts as above) to make 20mls culture medium. Add 200 μl of 200mM L- Glutamine, mix well and use for preparing cultures. This medium should be prepared fresh each time cultures are made. Artificial Seawater can be made from Instant Ocean (Aquarium Systems, Mentor, OH) or as follows: 450 mM NaCl, 10 mM KCl, 30 mM MgCl2(6H2O), 20 mM MgSO4, 10 mM CaCl2(2H2O), 10 mM HEPES, with pH adjusted to 7.4.