Preparação de Aplysia Sensório-motor Neuronal culturas de células

Summary

Culturas primárias de

Abstract

O sistema nervoso dos moluscos marinhos Aplysia californica é relativamente simples, consistindo de aproximadamente 20.000 neurônios. Os neurônios são grandes (até 1 mm de diâmetro) e identificável, com tamanhos distintos, formas, posições e pigmentações, e os corpos celulares são externamente expostas em cinco gânglios emparelhados distribuídos por todo o corpo do animal. Estas propriedades têm permitido investigadores para delinear os circuitos subjacentes comportamentos específicos no animal ^1. A conexão entre os neurônios monossináptico sensorial e motora é um componente central do reflexo de retirada gill-in do animal, um simples reflexo defensivo em que o animal retira a sua guelra em resposta à estimulação tátil do sifão. Este reflexo sofre as formas de aprendizagem não-associativa e associativa, incluindo a sensibilização, a habituação e condicionamento clássico. De especial interesse para o estudo da plasticidade sináptica, a sinapse sensório-motor pode ser reconstituída na cultura, onde bem caracterizados estímulos provocam as formas de plasticidade que correlaciona direta no comportamento do animal ^2,3. Especificamente, a aplicação de serotonina produz um fortalecimento sináptico que, dependendo do protocolo de aplicação, tem a duração de minutos (curto prazo facilitação), horas (médio prazo facilitação) ou dias (longo prazo facilitação). Em contraste, a aplicação do FMRFamide peptídeo transmissor produz um enfraquecimento sináptica ou a depressão que, dependendo do protocolo de aplicação, pode durar de minutos a dias (depressão a longo prazo). O grande tamanho dos neurônios permite a gravação eletrodo repetido acentuada da força sináptica ao longo de períodos de dias, juntamente com microinjeção de vetores de expressão, siRNAs e outros compostos para alvo específico cascatas de sinalização e moléculas e, assim, identificar os passos molecular e celular biológicos que estão por trás das mudanças na eficácia sináptica.

Uma vantagem adicional do sistema de cultura Aplysia vem do fato de que os neurônios demonstrar sinapse especificidade na cultura ^4,5. Assim, os neurônios sensoriais não formam sinapses com eles mesmos (autapses) ou com outros neurônios sensoriais, nem formam sinapses com não-alvo identificados neurônios motores em cultura. O varicosidades, sites de contato sinápticas entre os neurônios sensoriais e motores, são grandes o suficiente (2-7 mícrons de diâmetro) para permitir a formação de sinapses (bem como alterações na morfologia sináptica) com os neurônios motores alvo a ser estudado no nível de luz microscópica.

Neste vídeo, demonstramos cada etapa de preparação de culturas sensório-motor neurônio, incluindo adultos e anestesiar Aplysia juvenil, dissecando seus gânglios, a digestão protease dos gânglios, a remoção do tecido conjuntivo por microdissecção, a identificação de ambos os neurônios sensoriais e motores e remoção de cada tipo de célula por microdissecção, chapeamento do neurônio motor, além do neurônio sensorial e manipulação da neurite sensorial para o formulário de contato com a cultura do neurônio motor.

Protocol

Preparação (ver secção de soluções no final do protocolo para a composição de soluções)

1. Preparar pratos cultura. Revestimento de vidro bem de Mattek placa de cultura com fundo de vidro com poli-l-lisina (feita em borato de sódio). Adicione o suficiente para cobrir completamente o vidro bem e deixe por> 1h (pode ser deixado durante a noite). Remover completamente o poli-l-lisina por lavagem em água do mar artificial vezes (ASW) 4-5. Após a remoção da última lavagem, adicionar 2 ml de 50% L15 (suplementada com sais e contendo L-glutamina na concentração final de 2mM) / hemolinfa de 50%. Este meio de cultura deve estar no prato, pelo menos, uma hora antes do revestimento de células para que os casacos de hemolinfa do prato.
2. Limpar as ferramentas e pratos Sylgard com etanol, lavá-los abundantemente com DDH ₂ 0 e, em seguida, colocá-los para> 1 hora sob uma luz UV na capa cultura.
3. Prepare eletrodos afiada para microdissecção de neurônios. Utilizando um extrator de microeletrodos (por exemplo, Sutter Flaming Brown P-97), puxe eletrodos pipeta de vidro com 1,5 mm de diâmetro exterior, 0,86-1,12 mm de diâmetro interno e 100 mm de comprimento (por exemplo, AM catálogo do sistema # 628000; Instrumentos de Precisão Mundial TW150-4, 1,55 / 1,12). Use os parâmetros que produzem um eletrodo com uma ponta longa e fina wispy de alta resistência tal que não há a ingestão de líquido capilar quando colocados em solução. A presença de um menisco líquido significa que a ponta do eletrodo pode danificar neurônios durante o isolamento. O livro de receitas eletrodo Sutter fornece diretrizes excelentes para a criação de programas de eletrodo. Usamos um filamento de caixa, e um passo-pull para gerar eletrodos cultura.
4. Prepare solução anestésica (0,35 M MgCl2), meio de cultura (L15 suplementada com sais e hemolinfa), e solução de protease (1% protease tipo IX, Sigma, uma unidade / mg, para uma concentração final de 10 unidades / ml).
5. Animais: uso adulto 80-100 g Aplysia para o isolamento de neurônios sensoriais e de neurônios LFS motor. Use juvenil 1-4 g Aplysia para isolamento de L7 neurônios motores. Remova suavemente os animais dos tanques de água do mar, e manter na água do mar (em balde de copo, ou saco plástico) para não mais que 30 minutos antes do início da anestesia eo procedimento cultura.

Procedimento de cultura

Cultivar A. pleural neurônios sensoriais 80-100 g Aplysia

1. Anestesiar os animais para a remoção de gânglios: Inject 0,35 M MgCl ₂ em adultos Aplysia (80-100 g), utilizando uma seringa de 60 ml com uma agulha 18 gauge 1,5 polegada. Digite o pé do animal em um ângulo de aproximadamente 35 graus, e não entrar muito profundamente. O objetivo é injetar no hemocele do animal sem penetrar os órgãos internos. O animal deve tornar-se muito distendido e relaxado.
2. Dissecar os gânglios: Pin do animal anestesiado em um prato de dissecação, com um pino (18-gauge agulhas funcionam bem para animais 80-100 g) na cabeça ea cauda, ​​eo pé virado para cima. Segure o pé com uma pinça dentada e corte através da pele e do tecido conjuntivo subjacente a todo o comprimento do pé (da cabeça à cauda) com uma tesoura cirúrgica. Pin os dois lados para baixo. Usando uma pinça e tesoura, corte o esôfago e puxar para o lado para expor os gânglios. Usando uma pinça e tesouras bem fina, cortar o pedal gânglios pleural (os neurônios sensoriais são nos gânglios pleural). Deixar uma boa quantidade de nervos uma vez que este torna mais fácil de definir os gânglios após o tratamento protease.
3. Digestão protease de gânglios: Coloque os gânglios em solução protease (10 mg / ml de 1 unidade / mg em L15) em um conjunto de incubadora a 34,5 ° C (34-35 ° C está bem) durante 2 horas e 15min. Usando a pinça de ponta fina para transferir e lavar os gânglios no ASW três vezes. Mantenha os gânglios no L15. Note-se que o tempo de incubação pode variar de protease. O objetivo é permitir que o tecido conjuntivo que podem ser facilmente removidos. Se for muito difícil desheath gânglios sem danificar os neurônios, aumentar o tempo de incubação protease. Se ele é extremamente fácil de desheath os gânglios e os neurônios são "moles", e reduzir o tempo de incubação protease.
4. Desheathing os gânglios: Transferência da protease-digerida gânglios a uma 60 mm ou 35 milímetros prato contendo Sylgard e L15. Visualização sob um estereomicroscópio (com iluminação halógena externo), retire pedal gânglios e fechar os gânglios pleural no prato Sylgard na orientação correta utilizando os pinos de insetos e uma pinça fina. Com a pinça fina e uma tesoura cirúrgica Vanna, levante cuidadosamente o tecido conjuntivo e cortá-la para expor o cluster sensorial. Tenha cuidado para não tocar ou danificar sempre o somata neuronal. Remova qualquer excesso de tecido conjuntivo do prato e adicione mais meio, certificando-se de nunca expor o gânglio desheathed ao ar. O cluster sensorial consiste de aproximadamente 200 neurônios agrupados de 40-50 mícron de diâmetro. Definir um alfinete para fazer um "post" em uma curta distância do Ganglion (dentro do campo de visão).
5. Isolamento de neurônios: Usando longos, eletrodo de vidro cultura afiada, retire os neurônios identificados um a um, tocando o corpo da célula apenas fora do centro (não empalar) e lenta e progressivamente puxando a soma das células, juntamente com o axônio, longe do ganglionares. Bata suavemente contra o pino para desalojar os neurônios do eletrodo.
6. Neurônios chapeamento: Use um Pipetman (P10) para transferir os neurônios individuais do prato Sylgard a uma placa de cultura. Antes de transferir os neurônios, meio de cultura pipeta na ponta, para que a ponta de plástico é revestido com hemolinfa (o que impede os neurônios de degola para o plástico). Tome muito cuidado para evitar expor os neurônios para as bolhas de ar ou de quaisquer forças extremas (isto é, tomar muito cuidado para cima e remova os neurônios do pipetteman). Distribuir os neurônios uniformemente ao longo do prato. Use um eletrodo afiado para suavemente em linha reta os processos e toque-os para o fundo.
7. Incubação: Deixe os pratos no palco microscópio em temperatura ambiente por não menos de três horas. Rotineiramente, deixá-los durante a noite. Certifique-se que o estágio do microscópio é imperturbável durante este período. Cobrir o palco com folha de alumínio para proteger da luz. Gentilmente transferi-los para um jovem de 18 ° C incubadora.
8. Culturas devem aderir ao prato dentro de aproximadamente 3 horas e crescimento neurite novos devem ser visíveis dentro de cerca de 12/06 horas. O crescimento de neurônios sensoriais isoladas atinge um platô por DIV de 3 ou 4. Note-se que isolados neurônios sensoriais não doe autapses forma ou sinapses químicas uns com os outros, embora eles junções gap forma elétrica.

B. Elaboração de neurônio sensorial-motor neurônio cocultures

Neurônios sensoriais formam sinapse com os neurônios motores na cultura alvo. Os neurônios motores mais utilizados são os neurônios LFS motor eo L7 neurônio motor, do gânglio abdominal. Os neurônios LFS motor são isolados de adultos (80-100 g) Aplysia, e há cerca de 20 neurônios motores LFS por gânglio abdominal. O L7 do neurônio motor é isolado de juvenis (1-4 g) os animais, e há apenas um L7 por gânglios abdominal. LFS neurônios motores são de 40-50 mícrons de diâmetro, são intercaladas entre os neurônios sensoriais LE perto da raiz do nervo sifão na superfície ventral dos gânglios abdominal, e são caracterizadas por uma mancha de pigmento escuro sutis em cada soma. O L7 do neurônio motor é 100-150 mícrons de diâmetro e está presente na superfície dorsal do gânglio, na borda meio do lado esquerdo do gânglio. Embora seja mais econômico usar neurônios LFS motor, o grande tamanho do L7 do neurônio motor é vantajoso para algumas experiências. O L11 do neurônio motor, também na superfície dorsal esquerda do gânglio abdominal, caudal de L7, é um não-alvo do neurônio motor e pode ser efetivamente usado como um controle com o qual o neurônio sensorial fasciculates mas não formam sinapses químicas.

1. Anestesiar os animais para a remoção de gânglios. Para os neurônios LFS motor, faça como descrito para pleural neurônios sensoriais. L7 para os neurônios motores, injetar 0,35 M MgCl ₂ em juvenis Aplysia (1-4 g), utilizando uma seringa de 10 ml com uma agulha calibre 21.
2. Dissecar o gânglio abdominal: Pin do animal anestesiado em um prato de dissecação, como descrito acima (usando 21 agulhas para animais jovens). Usando uma pinça e tesouras bem fina, cortar os gânglios abdominais.
3. Digestão protease de gânglios: Isso é feito como descrito para pleural neurônios sensoriais, exceto que o tempo de digestão é reduzido para 1 hora e 45 min para gânglios da juvenil (1-4 g) animais.
4. Desheathing os gânglios: Transferência da protease-digerida gânglios a um prato de 35 mm ou 60 contendo Sylgard e L15. Visualização sob um estereomicroscópio (com iluminação halógena externo), nos gânglios no recipiente Sylgard na orientação correta utilizando os pinos de insetos e uma pinça fina. Com a pinça fina e uma tesoura cirúrgica Vanna, levante cuidadosamente o tecido conjuntivo e cortá-la para expor os corpos celulares neuronais. Para isolar os neurônios LFS motor, pino do gânglio modo que a superfície ventral é voltada para cima, e com uma pinça puxe a bainha de tecido conjuntivo para trás para expor toda a metade do gânglio contendo o LFS neurônios motores (à direita), o desheath restantes partes do gânglio, remover qualquer tecido conjuntivo da cápsula e adicionar mais L15. Para isolar o L7 ou L11 do neurônio motor, pino do gânglio modo que a superfície dorsal está virada para cima, e com uma pinça puxe a bainha de tecido conjuntivo para trás para expor a metade do gânglio contendo tanto L7 e L11 (a sua esquerda). Tenha cuidado para não tocar ou danificar sempre o somata neuronal. Coloque um alfinete para fazer um "post" a uma curta distância do gânglio (dentro do campo de visão).
5. Isolamento de neurônios: Remove os neurônios com um eletrodo afiado como descrito para os neurônios sensoriais. Os neurônios são LFS differentiated de neurônios vizinhos LE sensorial com base em um lugar pequeno e escuro pigmento em sua somata. O neurônio L7 pode ser diferenciado do neurônio L11 primeiro porque o L11 é caudal a L7, porque o corpo da célula L11 é mais alongado em forma, enquanto o corpo da célula L7 é mais arredondada e porque o axônio L11 tende a filial em duas perto do celular corpo.
6. Neurônios chapeamento: Use um Pipetman (P10) para transferir os neurônios individuais do prato Sylgard a uma placa de cultura, conforme descrito para os neurônios sensoriais.
7. Emparelhamento com neurônios sensoriais: Deixe os neurônios motores aderir à placa de cultura por pelo menos 1 hr. Em seguida, adicione os neurônios sensoriais isoladas com um Pipetman, entregando cada neurônio sensorial adjacente a um neurônio motor chapeado. Usando um eletrodo de vidro afiados cuidadosamente endireitar o axônio do neurônio sensorial, e persuadir o corpo da célula sensorial para uma posição ao lado do neurônio motor, a uma distância igual ou ligeiramente menor que o comprimento do axônio de células sensoriais. Usando o eletrodo de vidro, persuadir o axônio sensorial para entrar em contacto com o neurônio motor, muito suavemente usando o lado cônico do eletrodo para finalmente ter o axônio sensorial fisicamente em contato com o axônio do neurônio motor. Não levante a placa de cultura, mas sim suavemente deslizar o prato ao longo do estágio do microscópio.
8. Deixar os pratos no palco microscópio em temperatura ambiente por nada menos que 3 horas e transferir para uma incubadora de 18 ° C, conforme descrito para os neurônios sensoriais.
9. Culturas devem aderir ao prato dentro de aproximadamente 3 horas e crescimento neurite novos devem ser visíveis dentro de cerca de 12/06 horas. Neurônios sensoriais formam sinapses glutamatérgicas com neurônios motores muito rapidamente - assim como a célula é aderente o suficiente para executar a gravação de eletrodos pontiagudos (05/03 horas), um potencial pós-sináptico excitatório pode ser gravado. Conectividade sináptica continua a aumentar até 3 DIV, e depois é estável até DIV7. Os neurônios devem mostrar crescimento de neuritos elaborados durante os primeiros 1-3 dias em cultura.

C. Preparação de hemolinfa

Hemolinfa é usado como um fator de crescimento na cultura Aplysia (análogo ao uso de soro fetal bovino em cultura de células de mamíferos). Ela é recolhida a partir de grandes dimensões (500 g-1 kg) de animais, ea melhor época para coletar hemolinfa (anecdotally) é durante a primavera (meados de março a junho). Swaddle o animal em um underpad descartáveis ​​para que apenas uma pequena parte do animal é exposto, limpa a parte da pele com o etanol, e depois mantê-lo enquanto outra pessoa usa uma lâmina estéril para fazer uma incisão na área exposta. Aperte o animal para que o squirts hemolinfa em um copo limpo, certificando-se que não entra em contato com a pele suja do animal. A hemolinfa enche a hemocele do animal (ou seja, o animal é basicamente um saco de hemolinfa). Rewrap o animal uma ou duas vezes, fazer uma nova incisão e apertar difícil coletar hemolinfa, tanto quanto possível (a cobrar em um copo novo de modo que se torna-se contaminado, a primeira coleção ainda é utilizável). Hemolinfa de cada animal devem ser mantidos separadamente (isto é, não hemolinfa piscina de animais diferentes). Girar a hemolinfa a 2000 xg por 10 min para remover células do sangue. Sobrenadante da alíquota em 10 alíquotas ml, rótulo animais e armazenar a -80 ° C. Note-se que hemolinfa armazenadas a -20 ° C forma um precipitado no meio. A nova alíquota da hemolinfa deve ser usado todos os meios de cultura o tempo é preparado, e as alíquotas devem ser descongeladas apenas antes de preparar o meio. Não voltar a congelar após descongelação.

Discussion

O êxito da preparação Aplysia sensório-motor culturas tem uma curva de aprendizado um pouco lento, pois envolve o desenvolvimento de habilidades motoras finas associados com microdissecção e manipulação de neurônios individuais visualizada através de um estereomicroscópio. Em nossa experiência, que leva cerca de 1-3 semanas de prática para obter saudável isolado neurônios sensoriais na cultura e uma semana adicional 1-3 para aprender a par de neurônios sensoriais com os neurônios motores. Rotineiramente preparar culturas em um banco Labconco Limpo, embora seja possível para prepará-los em qualquer bancada do laboratório ou da mesa, enquanto o microscópio é imperturbável durante o cultivo (qualquer vibrações ou distúrbios mecânicos evitar os neurônios de aderir). Uma vez que os neurônios crescem em água do mar a 18 ° C contaminações, bacterianas e fúngicas são significativamente menos comum do que em cultura de células de mamíferos. A variável mais importante na preparação da cultura é a qualidade do animal. Aplysia podem ser comprados de fornecedores que recolhê-los directamente a partir do Oceano Pacífico (Alacrity, ou Marinus), ou da Universidade de Miami instalação Maricultura, que reúne casais reprodutores do Pacífico e, em seguida, cresce Aplysia através de um ciclo reprodutivo. Como tal, os animais são geneticamente heterogêneas, e, no caso dos animais recolhidos do oceano, eles também são heterogêneos em termos de história ambiental. Há alguma sazonalidade com a qualidade de neurônios obtidas a partir Aplysia, com o pior período que ocorre geralmente em agosto, e outro período de baixa qualidade em torno de dezembro. Outra variável importante é a hemolinfa. É sábio para testar diferentes lotes de hemolinfa por sua capacidade de promoção do crescimento, e para usar o mesmo lote de hemolinfa para um conjunto de experimentos.

Apesar da dificuldade de preparar culturas Aplysia neuronal, que possuem uma série de vantagens únicas e valiosas para o estudo da formação de sinapses e plasticidade sináptica. Eles formam conexões monossináptico na cultura que pode ser monitorado através da gravação eletrodo afiada por períodos de dias. Protocolos bem caracterizado existem que provocam as formas de plasticidade que tem claros paralelos no comportamento do animal. Estímulos podem ser aplicadas para o banho ou para subconjuntos de synapses6, 7, e da geometria das culturas pode ser variado de modo que um neurônio sensorial contatos um único neurônio motor, ou um neurônio sensorial com um axônio contatos bifurcados dois neurônios motores, sensoriais ou dois neurônios em contato com um neurônio motor individual. Molecular e celular caminhos biológicos podem ser alterados em neurônios individuais por microinjeção de DNA, RNA, siRNA e outros reagentes, e os efeitos sobre a estrutura e função neuronal, a transmissão sináptica e plasticidade pode ser monitorado com resolução temporal e espacial. O NIH e Broad Institute estão em fase de conclusão do seqüenciamento do genoma Aplysia, que deve

Materials

Solutions needed for culture 0.35 M MgCl2, stored at room temperature, used for anesthesia. Poly-L-lysine solution, Sigma: P-1524, MW >300,000, made in 0.1M Sodium Borate pH8.2 to 0.5mg/ml solution. Vortex well and filter sterilize through a 0.22 μm filter, store it at 4C°. Do not freeze-thaw. L-15 Medium powder (Leibovitz) (Sigma: L4386) supplemented with the salts as below to make 1 liter L-15 powder 13.8g NaCl 15.4 g D-Glucose 6.24 g MgSO4•7H20 6.45g KCl 350 mg NaHCO3 170 mg MgCl2•6H2O 5.49 g CaCl2•2H2O 1.43g HEPES 3.53g Add ddH20 to 1 liter. The pH should be about 7.4-7.5, add 10ml of 100X Pen/Strep solution, and filter-sterilize through a 0.22 μm filter. Store at 4C0 for no longer than 1 month. Protease digestion solution: 1% Protease IX (1unit/mg) is made in L15 (supplemented with salts as above) or in ASW immediately before use, filter-sterilized through a 0.22 μm Millipore. 5mls should be enough for the ganglia from two animals (make sure the ganglia are completely immersed in protease solution). Sigma has reported that they will discontinue selling Protease IX. A substitute protease is: Dispase II (Roche Applied Science catalog # 04942078001). Culture medium. Immediately prior to preparing cultures, thaw a 10 ml aliquot of hemolymph and mix it with 10 mls of L15 (supplemented with salts as above) to make 20mls culture medium. Add 200 μl of 200mM L- Glutamine, mix well and use for preparing cultures. This medium should be prepared fresh each time cultures are made. Artificial Seawater can be made from Instant Ocean (Aquarium Systems, Mentor, OH) or as follows: 450 mM NaCl, 10 mM KCl, 30 mM MgCl2(6H2O), 20 mM MgSO4, 10 mM CaCl2(2H2O), 10 mM HEPES, with pH adjusted to 7.4.