Summary
אנו מתארים תהליך באמצעות לייזר ללכוד microdissection לבודד תמצית RNA מתוך אוכלוסייה הומוגנית תא, עצב פירמידליים, בשכבה III של gyrus הזמני מעולה במוח האנושי שלאחר המוות. לאחר מכן אנו להגביר באופן ליניארי (T7 מבוססי) mRNA, ועל להכליא את המדגם כדי האנושית Affymetrix X3P microarray.
Abstract
הצענו לחקור את צמצום החומר האפור ברכס הרקתי מעולה לראות חולי סכיזופרניה, על ידי חקירת ביטוי גנים פרופילים של עצב פירמידליים בשכבה III. זה ידוע היטב כי קליפת המוח הוא מבנה הטרוגני במיוחד הכולל אזורים שונים, שכבות סוגי תאים, שכל אחד מהם מאופיין קומפוזיציות תאית ומולקולרית ברורים ולכן ההפרש ביטוי הגן פרופילים. כדי לעקוף את ההשפעות של בלבול ההטרוגניות רקמות, השתמשנו לייזר ללכוד microdissection (LCM) כדי לבודד תאים מסוג מסוים שלנו נוירונים כלומר פירמידה.
כ -500 עצב פירמידליים מוכתם הפתרון מכתים Histogene נלכדו באמצעות מערכת XT ארקטורוס LCM. RNA היה מבודד אז מתאי בשבי ועבר שני סיבובים של הגברה T7 מבוססי ליניארי באמצעות ארקטורוס / מולקולרית ערכות התקנים. LabChip Experion (Bio-Rad) ג'ל ו electropherogram הצביעו באיכות טובה (מ ') RNA, עם אורך התמליל הארכת 600nt בעבר נדרש microarrays. כמות ה-mRNA השיג ממוצעים 51μg, עם טוהר מקובל מדגם מתכוון כפי שעולה יחס A260/280, של 2.5. התבטאות גנים היה צדודית באמצעות מערך האדם X3P GeneChip בדיקה מ Affymetrix.
Protocol
1) חתך רקמות:
השגנו את הרקמה הכרחי (שליטה n = 9, סכיזופרניה n = 9) ממרכז ברקמת המוח הרווארד משאבים, מתאימים עבור מרווח, גיל, מין שלאחר המוות (PMI) (טבלה 1). חנקן נוזלי בלוקים אדי היו 3mm כ עבה נלקחו מאזור של Brodmann 42 (gyrus הזמני מעולה).
לפני תחילת מכתים של עצב פירמידליים, התנאים חייב להיות מותאם על מנת להשיג רקמה אופטימלי "להרים" ואת איכות גבוהה RNA. רקמות "להרים" מתאר את התהליך במהלך microdissection לייזר ללכוד, שבו נוירונים המסומנים ללכוד לדבוק כובע ומופרדים בעוד רקמות שנותר הוא נשאר מאחור.
אופטימיזציה:
- על מנת להקטין את פעילות RNase, אשר פשרות באיכות RNA, לטפל כל המשטחים, כולל אזור העבודה, חתך להב שקופיות עם פתרון טיהור RNase, כגון RNase זאפ, בנוסף וניגבתי אתנול 100%.
- סעיף הרקמה עם cryostat שנקבע ב -17 ° C. פעולה זו מפחיתה את שיפוע הטמפרטורה בין טמפרטורת החדר (שקופיות), cryostat, ואת קרח יבש (ראה התהליך כולו להלן). אם הטמפרטורה נמוכה מ -20 ° C, בסעיפים רקמות נוטים לגרוס, טיוח אותם שמיש. גבוהה, ואת שיפוע הטמפרטורה, אשר יכול לסכן את שלמות RNA.
- הסעיפים צריכים להיות 8μm עבה, כמו בסעיפים עבה בסופו של דבר לפשרה רקמה "להרים". עובי זו גם מאפשרת זיהוי נכון של עצב פירמידליים עבור לכידת.
- שימוש רגיל שקופיות הזכוכית טעונים (למשל Histogene שקופיות LCM) כמו אלה אינם מפריעים "להרים" רקמה בתהליך לייזר לכידת. מגלשות ממברנה עשויה לשמש גם, אבל אלה מתאימה יותר בידוד מבנים רקמות גדולות, כמו קרום נוטה להרים מעט במהלך תהליך לייזר לכידת, ובכך להגדיל את המקום אינפרא אדום (IR) גודל לייזר ולהפחית סגוליות התא.
- הר שני חלקים לכל שקופית זכוכית, כמו יותר משני חלקים לכל שקופית עלול לסכן את איכות RNA עקב וריאציה קבוע בטמפרטורה במהלך תהליך חתך.
- לאחר חתך, במקום שקופיות מיד לתוך תיבת להחליק על קרח יבש מיקרו על מנת לשמור על שלמות RNA. תיבות החלק המכיל את החלקים במוח מאוחסנות לאחר מכן ב -80 ° C עד מעובד.
קבענו בעבר כי עצב פירמידליים, 500 תאים לכל מקרה מספיקות כדי לרכוש רנ"א מספיק הכלאה microarray. כ לארבעה חלקים נחוצים לכל מקרה, בעיקר בשל חתך והכתים חפצים.
2) צביעה של עצב פירמידליים:
זיהוי של עצב פירמידליים מושגת עם פתרון מהיר Histogene מכתים וערכת, שכן היא מאפשרת לנו לדמיין אלו נוירונים, ללא חשיפה ממושכת תמיסות מימיות, ובכך לשמר RNA.
- היכונו ההליך מכתים ידי הוספת 1μl מעכב RNase לכל 100μl של פתרון מכתים (למשל Promega) כדי להגביל את פעילות RNase. ארבעה סעיפים (2 שקופיות), דורשים 4μl של RNase מעכב נוסף 400μl הפתרון Histogene מכתים בצינור microcentrifuge 1.5ml (שמר על הקרח). עבור כל מקטע, אנו משתמשים 97μl של פתרון זה, אשר נותן לנו כתם נאותה לזהות עצב פירמידליים.
- הכן סדרה התייבשות קסילן: 25ml aliquot של ethanols המתאים לתוך צנצנות מכתים המסופק עם ערכת Histogene, כלומר 2x75%, 95%, 100% ו -2 צנצנות של מים RNase חינם. שמים את כל הצנצנות בתוך דלי קרח, למעט צנצנת one 75%, אשר תמקם במקפיא C -20 °. מתחת למכסה המנוע קטר, להוסיף מסננות מולקולריות לצנצנת קסילן להסרת עודפי מים, אשר עלול לסכן את רקמת "להרים".
- הפעל את waterbath (או לחסום חום) עם הטמפרטורה מוגדר 42 ° C ו 50 מ"ל במקום השפופרת פלקון נתמך על ידי מדף waterbath.
- הסר שתי שקופיות מ -80 ° C ו להפשיר אותם KimWipe למשך כ -30 שניות, או רק עד בפינות של השקופיות מתחיל להפשיר.
- בקצרה לתקן את השקופיות אתנול 75% למשך 30 שניות ב -20 ° C במקפיא. העברת שקופיות בין צנצנות מכתים באמצעות RNase-תיזזה מלקחיים כדי להפחית את הזיהום.
- אחרי רחצה 30 השני מים nuclease חינם, סעיפים ניתן התווה עם עט מחסום PAP על מנת לרכז את הפתרון בסעיף, אולם עם שקופיות הזכוכית רגיל זה לא הכרחי.
- הכתם לארבעה חלקים עם פתרון Histogene מכתים למשך 20 שניות, עם 97μl של מעכב את הכתם / RNase לכל סעיף. לאחר מכן, מייבשים את הסעיפים ethanols הכין בעבר על הקרח, למשך 30 שניות לכל שלב. השלב הסופי אתנול 100% יש להרחיב עד 3 דקות, על מנת להשיג התייבשות מספיק "להרים" מספיק רקמות ללכוד אל כמוסות LCM.
- לטבול את השקופיות של קסילן במשך 5 דקות אוויר יבש ברדס קטר, לעוד 5 דקות לפני הלכידה.
הצעדים מכתים צריכה להתבצע רק אם לייזר לכידת מיד לאחר מכן. כל הפתרונות יש לשנות כל 4-6 שקופיות על מנת למנוע זיהום ולהבטיח התייבשות הנכון.
3) תא יחיד לייזר ללכוד microdissection:
לאחר מכתים, עצב פירמידליים משכבת השלישי מוסרים באמצעות לייזר ללכוד microdissection, עם מערכת ארקטורוס XT ותוכנה. בקצרה, המערכת עובדת על ידי פועם לייזר כוח מתכוונן IR באמצעות סרט תרמופלסטיים הממוקמת בבסיס של כובע, וכתוצאה מכך הארכת / distension של הסרט ישירות על התאים של עניין. כאשר הוא הרים את המכסה מן הרקמה, התאים נשארים שבויים / שבוי על המכסה. סיכום ציורי ניתנת באיור 1.
לפני הפעלת פרוצדורה זו, חשוב להבחין בין שני סוגים של כמוסות זמין עם מערכת זו. בעוד כובע CapSure מאקרו משמש בדרך כלל מבנים גדולים יותר עבור לכידת רקמות, HS כמוסות CapSure נועדו ללכוד מספר קטן של תאים בודדים ולכן כמוסות אלה בעלי שטח פנים קטן המיועד ללכוד. כמוסות HS יש גם מסילות המונעות את הכובע מלהיות בקשר ישיר עם סעיף הרקמה, בעוד שווי מאקרו לא. מסילות אלה מפחיתים את ההשפעה של קיפול רקמות שעשויים להשפיע או לגרום ההשתנות של גודל נקודה (של הדופק לייזר) כמו כובע מאקרו יושב ישירות על רקמות, מקופל אחידה. במשך ההליך, השתמשנו כמוסות HS לנצל את יכולתם להפחית את ההשפעה של קיפול רקמות, אך שמרו על הגדרות מאקרו כובע על התוכנה על מנת למקסם את השטח נתפס כפי שאנחנו ללכוד מספר גדול של תאים.
- טען את השקפים וכובעים על המנגנון ארקטורוס XT. השתמש HS כמוסות CapSure, אבל לשמור את הגדרת התוכנית על מאקרו. לחץ על "טען עם סקירה" את התיבה כדי לקבל תמונה כללית של כל שקופית.
- התאם את בהירות / להתמקד בהגדלה 2x, על מנת לקבוע איזה סעיף יהיה אופטימלי עבור לכידת לייזר. הימנע סעיפים רקמה עם קיפול מופרז, אלא לבחור חלקים כי הם שלמים, חלק, מוכתם היטב, במיוחד ליד אזור של אינטרס כלומר שכבה III.
- לאחר מכן, אנו במקום כובע מעל האזור הכללי שבו נהיה לכידת, מוודא לכלול שכבה III. ובכל זאת בהגדלה 2x, לוודא כי מסילות כובע לא לנוח על קפלי כל, כמו זה יהיה להטות את הכובע.
- בשלב הבא, נאשר את המיקום של המקום לייזר IR ידני בהגדלה של 40X. אם הנקודה (אדום קרן) אינו מתאם עם הצלב הכחול, זה יכול להיות מותאם על ידי לחיצה ימנית על המקום ובחירת "במקום IR הנמצא".
- ב 40X, אנחנו יכולים להתחיל לזהות עצב פירמידליים על פי הקריטריונים הבאים (1) בתאים בצורת פירמידה ו (2) את החלק הפרוקסימלי של הדנדריטים apical ו / או הבסיס ניתנים לזיהוי (איור 1A).
כעת אנו להתאים את העוצמה ואת משך הדופק לייזר על מנת ללכוד את נוירון פירמידלי. הדבר חשוב במיוחד, שכן הוא קובע את הספציפיות של התא שנתפסו בנוסף למספר התאים בשבי. אם הדופק הוא חלש מדי לא כל הנוירונים מזוהה יהיה בשבי, בעוד אם הדופק חזק מדי זה יכול ללכוד תאים ברקמות שמסביב / אחר מאשר נוירון לבד. בדרך כלל, עם מפרט רקמות תאים מועסק כאן, את עוצמת הלייזר (70mW) ומשך (16msec) תוצאה בגודל נקודה של 25μm, בערך בקו אחד עם גודל נוירון פירמידלי (איור 1B). עם זאת, הגדרות אלה הן מכויל על כל קטע על מנת לקבל בערך בגודל נקודה זהה לכל מקרה. אם "להרים" נפגעת, תמיד אפשר להגדיל את מספר התאים בשבי על מנת לשמור על כמות של RNA המתקבל בכל מקרה דומה. עם זאת, הקפידו לשמור על הזמן שלך ללכוד כולל צביעה לפי 1.5 שעות, זמן רב יותר מאשר זה יכול להתפשר באיכות RNA.
- ראשית לשמור את המיקום של כובע על ידי לחיצה על סימן הפלוס באירוע העמדה. בדרך זו, אם מסיבה כלשהי אנו חייבים להסיר את הכובע ואז צריך לשים אותו שוב באותו מקום, כובע יהיה תמיד לחזור למקום בדיוק אותו אתה מותאם לגודל של נקודה.
- הזן את הערכים הללו לתוך הקופסה מלאה: 70 לשלטון לתוך משך 16. ובטל את "לזוז בשלב אוטומטי" אפשרות, ולוודא כי סמל בגודל הנכון בקורלציה עם סמל בלוח ימינה.
- בחר באפשרות עיגול (ימין למטה) כדי לבחור נוירון כי אתה רוצה לבדוק ללכוד, ולאחר מכן להפעיל את הלייזר על ידי לחיצהעל "כתם IR מבחן".
- הנקודה שנעשו על ידי הלייזר צריך ראשית יש טבעת כהה ופריך סביב האובייקט בשבי. אם טבעת זה קל מדי, התא לא נתפס. אם יש כתם כהה במרכז הטבעת כהה, אזי כוח לייזר / משך גדול מדי, וזה עלול להיות השפעה שלילית על ההווה RNA בתא בשבי. ודא כי הטבעת הוא גדול מספיק כדי להכיל את התא, אך קטן מספיק כי הוא אינו כולל רקמות לא רצויות או תאים אחרים.
- חזור על התהליך על חלקים שונים של רקמות בתוך שכבת שברצונך ללכוד, כדי לבדוק את גודל המקום אינו שונה בהתאם למיקום. התאם בהתאם.
- לאחר נקודה לייזר הותאם, ממשיכים לזהות עצב פירמידליים עבור לכידת. אנו מזהים כ 500 תאים לפי המדגם, אשר התוצאות 500pg כ רנ"א הכולל לדגימה. כמו כן, אנו בדרך כלל משתמשים רק קטע אחד על מנת לצמצם את כמות הזמן ללכוד, כמו כובע צריך להיות וסידרה עבור כל מקטע. לאחר שזיהית את כל התאים שאתה צריך, לחצו על לחצן לייזר ללכוד כל התאים שלך תאותר אוטומטית על המכסה (איור 1C).
- לאחר כל התאים נתפסו, להזיז את הכובע לחלק אחר של השקופית שאינו מכיל קטע. חזור שבו תאים נתפסו לוודא כי לפחות 90% של נוירונים הוסרו. אם לא, לא מנסה לשחזר את אותם תאים, אך לאתר את האזור שבו רוב התאים נתפסו, ו ללכוד תאים נוספים באותו אזור. הזז את הכובע לתחנת QC.
- מניחים את הכובע לתוך הצינור microcentrifuge 0.5ml של Applied Biosystems (קט # N8010611) המכיל 50 מ"ל של מיצוי חיץ (PicoPure RNA ערכת בידוד). כובע תוכנן להתאים באופן מושלם לתוך הצינור הספציפי הזה, כדי למנוע דליפת המאגר.
- סובבו את הרכבה הפוכה, ולוודא כי חיץ מיצוי מכסה את הכובע כולו, ולמקם אותו בתחתית הצינור פלקון 50 מ"ל הנוכחי כבר להגדיר את waterbath על 42 ° C. הנוירונים מודגרת במשך 30 דקות על מנת להסיר את הרקמה מן הכובע.
- לאחר מכן, צנטריפוגה הצינור והרכבה כובע למשך 2 דקות על 800 גרם. הסר את המכסה ולאחסן את תמצית התאים הנותרים ב -80 ° C עד מיצוי RNA. כאמצעי זהירות נוסף, אתה יכול לבחון מחדש את הכובע בתחנת QC במכשיר לייזר לכידת מנת להבטיח כי כל הנוירונים הוסרו כובע עצמו.
4) קבלת RNA מאוכלוסיות עצבי ספציפי:
אפשר ללכת ישירות לכידת לבידוד, או להפשיר את המדגם לאחסן במקפיא -80 מעלות צלזיוס. בניסוי שלנו, אנחנו הראשונים אספו את כל דגימות הצורך לאחסן אותם ב -80 ° C לפני שתמשיך RNA בבידוד.
בידוד RNA מבוצעת באמצעות ערכת בידוד PicoPure, אשר נועד לבודד מספר קטן של תאים מדגימות LCM ולשמר נמוכה שפע mRNA. באופן כללי, אנו עוקבים אחר הפרוטוקול המצורף לערכה. להלן נבקש לתת תיאור בסיסי של התהליך.
- לאחר ההפשרה, להוסיף 70% אתנול (המסופק עם ערכת) ו צנטריפוגה על טור טרום מותנה טיהור על מנת לאגד את הרנ"א לסנן את העמודה.
- לאחר כביסה, לטפל RNA עם DNase על מנת להבטיח הסרה מלאה של ה-DNA כדי להסיר את הסיכון להפרעות DNA. שלב זה חשוב במיוחד ביישומים במורד כגון בזמן אמת qRT-PCR.
- בעקבות לעכל את ה-DNA, יש עוד צעד לשטוף. בדוק כי אין חיץ לשטוף נשאר בעמודה לפני העברת צינור אחר microcentrifuge, כמו כל נוכחות של למאגר במדגם הסופי שלך תגרום פחות החל רנ"א עבור הגברה. כדי להבטיח זאת, אנו צנטריפוגות לשטוף את הצעד הסופי של 2.5 דקות במקום 2 דקות כפי שהוצע בפרוטוקול סיפק.
- לבסוף, חיץ elution מתווסף וטופחו על המסנן בעמודה דקה 1 ואחריו צנטריפוגה, כדי elute רנ"א מוחלט.
- פיפטה 1.3ul של כל אחד דגימות צינורות 0.5ml נפרד להפעיל HighSens Experion LabChip. להקפיא את שאר המדגם ב -80 ° C.
בקרת איכות חשובה מאוד כאשר בידוד RNA, במיוחד כאשר כמות קטנה את הסכום הדרוש, כגון ניסויים microarray (15μg), הוא גדול. RNA חילוץ ולכן חייבים לעבור בקרת איכות בנקודות זמן שונות לאורך כל התהליך. הראשונה מתרחשת לאחר החילוץ. אנו להקים את שלמות מוחלטת RNA באמצעות בדיקת ברוטו של פסגות 18S/28S של electropherograms וג'ל וירטואלי שנוצר על ידי Experion HighSens LabChip. שיטה זו היא מהירה מספק שני אמצעי המדידה כדי לבדוק RNA איכות electropherogram וכן ג'ל וירטואלי (איור 2). אם איכות של RNA הכולל הוא טוב יחסית (איור. 2A, B מול C, D), אנו ולאחר מכן להמשיך עם ליניארי מגביר את ה-mRNA, המהווה% בערך 2 של ה-RNA מוחלט.
5) בשכבות הגברה:
הגברה של רנ"א מופק לייזר שנתפסו ברקמות הכרחי על מנת לייצר כמות מספקת של רנ"א עבור הכלאה microarray עתידיים qRT-PCR ניסויים. כדי למזער את האפשרות של בלבול פוטנציאלי ציין עם הגברה T7 מבוססי ליניארי, אנו לצמצם את מספר סבבי הגברה הכרחי ידי הגדלת כמות ההתחלה לייזר שנתפסו חומרים ברקמות.
נתונים ראשוניים שלנו (לא מוצג) עולה כי שני סבבים של הגברה ליניארית (RiboAmp HS PLUS הערכה) של RNA סך שחולצו מן רקמות שמכילות כ 500 תאים יפיק כ 50μg של ארנה - מספקת ביצועים של שני microarray qRT ו-PCR ניסויים. אם אפשר, להימנע מעבירה מיותר המדגם בין 0.2ml ו 0.5ml צינורות באמצעות לחסום 0.5ml ב Cycler תרמי צינורות 0.5ml המסופק בערכה.
שוב, את פרוטוקול אחריו הוא זה המסופק עם הערכה. גרסה מקוצרת מתואר כאן.
- הוסף 1μl של פריימר הניתן המדגם RNA הכולל (כ 11μl) ו לדגור על 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ואחריו מצמרר על 4 מעלות צלזיוס למשך דקה 1.
- הוספת רכיבים גדיל first cDNA יחד עם transcriptase III הפוך עילי ו לדגור על 42 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
- לאחר סינתזה זרם שני cDNA, לטהר את cDNA כתוצאה דרך עמודה טיהור סיפק. כאן אנו ממליצים כי בעת העברת המדגם בתוספת חיץ מחייב לעמודה טיהור, כדי בצנטריפוגה דוגמיות פעמיים - פעם אחת לאחר העברת דגימת לעמודה, כמו עד 1μl המדגם נשאר על דפנות הצינורות לאחר ההעברה.
- שטפו את cDNA עם מאגרים לשטוף סיפק elute cDNA מטוהרים עם למאגר elution.
- מוסיפים את ברכיבים חוץ גופית שעתוק דגירה במשך 6 שעות 42 ° C.
- אחרי צעד DNase, לטהר את ארנה וכתוצאה מכך עם מאגרים סיפקה, בסופו של דבר משחררי זה סך של 12μl של חיץ elution.
RNA עובר סיבוב נוסף של הגברה ליניארית (עם פריימרים נפרד - ראה פרוטוקול הערכה), לאחר יותר לשלוט באיכות צעדים מועסקים. אחת ul המדגם הוא מדולל לכ 250ng/ul כדי לקבוע את אורך תעתיק mRNA וריכוז עם LabChip StdSens (Experion). מסורתית Affymetrix microarray הטכנולוגיה דורש mRNA להיות לפחות 600 נוקלאוטידים באורך כדי להיות מזוהה. ג'ל electropherogram המתקבל LabChip צריך אפוא לתאר את ה-mRNA מינימום תמליל אורך (איור 3).
בקרת איכות נוסף נקבע באמצעות ניתוח ספקטרופוטומטר NanoDrop, שם יחס מורכב משני צפיפות אופטית, כלומר A260 ו A280, קובע טוהר RNA. דוגמאות עם צפיפות אופטית סביב 2.1 צריך להיות מתויג ניתוח ביטוי גנים, למרות יחסי עד 2.7 הוכחו יש איכות הכלאה דומה. הריכוז צריך להיות גם בין 800ng/μl-1μg/μl, כפי נמוך יותר מאשר זה הוביל RNA השפלה בעוד אחסון (גם בטמפרטורות נמוכות מ -80 ° C) הובילה גם תוצאות microarray עניים.
6) ביוטין תיוג דגימות mRNA לניתוח microarray Affymetrix:
הערכה תיוג TURBO ביוטין (סוף תיוג) מן התקנים מולקולריים משמש התווית ארנה המתקבל דגימות מוגבר. גרסה מקוצרת של הפרוטוקול ניתנת כאן.
- כוון את עוצמת הקול של 20 מיקרוגרם של כל דגימה ארנה לסך 13μl ידי הוספת nuclease ללא מים או על ידי ריכוז המדגם בצנטריפוגה ואקום, תלוי בריכוז הראשוני. למרות בלבד 15μg הכרחי השבב Affymetrix בשימוש, נוסיף 20μg לתגובה הראשונית, כמו כמה RNA הוא איבד במהלך הדגירה ו צנטריפוגה.
- דגירה התגובה ביוטין על 85 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ולאחר מכן לצנן ב 4 ° C.
- הסר את התווית ביוטין עודף באמצעות צנטריפוגה עם הטור התמחה המסופק עם הערכה. במקרים מסוימים, במיוחד עם ה-mRNA מושפל כמו זה המתקבל FFPE (פורמלין-קבוע, פרפין, מוטבע) דגימות, זה יכול להיות מקרה שלא כל ה-mRNA הוא eluted בשלב צנטריפוגה בודדת. לאחר מכן, אנו ממליצים להוסיף מים בין 1-5μl nuclease ללא תוספת לעמודה בצעד צנטריפוגה לאחר מכן תוספת של דקה 1. הדבר מבטיח כי רוב המדגם שכותרתו היא eluted.
- היקף הסופי 20μl, עם ריכוז של 1μg/μl. אם תוספת nuclease ללא מים נוסף, לרכז את דגימות לנפח נכונה עם צנטריפוגות ואקום. אנו ממליצים לשמור על ריכוז האחסון לפני תחילת הכלאה על 800ng/μl, שכן מצאנו כי פחות זה יוביל השפלה במהלך ואחסון / או הכלאה וכתוצאה מכך תוצאות microarray עניים.
ארנה היתה הכלאה אז ביטוי גנים צדודית, באמצעות מערך האדם X3P GeneChip בדיקה מ Affymetrix. כאשר שבב זה תוכנן עבור ארנה מושפל יותר, השתמשנו בו כאמצעי זהירות, שכן גורמים רבים שאנחנו לא יכולים לשלוט יכול להשפיע על איכות הרקמה שלאחר המוות. כפי המעבדה שלנו לא היו מתקני נאותה הכלאה, התהליך בוצע במתקן שותפים Core הגנום.
נציג תוצאות:
רקמות 1 +2 +3) חתך, מכתים של עצב פירמידליים לייזר ללכוד microdissection:
פרוטוקול המתואר לעיל צריך להביא שתי שקופיות עם ארבעה סעיפים לכל שקופית. כל קטע צריך להיות חלק עם מינימום קריעה, פיצוח מתקפלים. עם צביעה נכונה, הכתם יזהה עצב פירמידליים מוכתם כהים סביב 20 - 25μm בגודל עם צורה פירמידה והדנדריטים apical גלוי. עם כובעים HS CapSure ב הגדרות מאקרו, והתאמה נכונה של הכוח לייזר כוח עבור כל מקטע, אתה צריך להשיג בסביבות 500-700 תאים לכל סעיף / במקרה וכתוצאה מכך לפחות 500pg של רנ"א מוחלט. כ -85 - 100% של הנוירונים תדבק המכסה (איור 1).
4) קבלת RNA מאוכלוסיות עצבי ספציפי:
כפי שתואר, לאחר בידוד RNA בסך הכל, אנחנו בודקים את איכות RNA באמצעות electropherogram וג'ל וירטואלי באמצעות Experion Bio-Rad. ב electropherogram, אתה צריך לראות שני שיאים ברורים המתאימים 18S ו -28 יחידות RNA ריבוזומלי. עם רקמה שלאחר המוות, לעומת זאת, זה לא תמיד המקרה, כמו רקמות עשויה להיות מושפל בשל גורמים לפני חתך. בדרך כלל תראה השפלה בליטה גדולה המעיד, עם שיא גדול סביב 18S, ו -28 שיא קטן (איור 2 א ', ב). כל עוד פרופילים electropherogram דומים ברחבי דגימות, מצאנו זו הנחיה להביא איכות mRNA מספיק טוב כדי לבצע את שתי RT-PCR ו microarray מחקרים (Imbeaud et al. 2005).
אם יש השפלה גדולה מדי - כפי שצוין על ידי שטח גדול מתחת לעקומה של electropherogram, או אם פסגות אינם גלויים (איור 2 ג, ד) - התאים צריך להיות שנתפסו שוב מן הרקמה. אנו ממליצים גם עושה מבחן רקמות לגרד, שם RNA מופק שברי שלם של הסעיף (לא רק תאים), לפני recapturing התאים כדי לקבוע אם לחסום רקמות עצמו מושפל.
5) בשכבות הגברה:
כדי לבדוק את האיכות של ה-mRNA לאחר שני סבבים של הגברה ליניארית, עשינו שימוש הן Bio-Rad Experion StdSens LabChip ואת ספקטרופוטומטר NanoDrop. מסורתית Affymetrix microarray הטכנולוגיה דורש mRNA להיות לפחות 600 נוקלאוטידים באורך כדי להיות מזוהה, אשר הושג עם פרוטוקול זה. למעשה, באורכים mRNA התגלו לתחום 1000-נוקלאוטיד. Electropherogram משקף גם את זה עם פסגות גדול לאט יורד כפונקציה של זמן (איור 3 א, ב).
קריאות NanoDrop הצביעו בממוצע A260/A280 יחס של 2.5 על דגימות, המעיד על mRNA קיימא (טבלה 2).
התוצאות שלנו מעידות כי עם פרוטוקול זה, הן את הכמות והאיכות של RNA שהושג הוא מספיק טוב כדי לחקור ביטוי גנים באמצעות ההבדלים האנושי Affymetrix X3P GeneChip.
6) ביוטין תיוג דגימות mRNA לניתוח microarray Affymetrix:
לאחר הכלאה של אדם Affymetrix X3P GeneChip, השגנו שיחות אחוזים בממוצע 26.6% (טבלה 2), המעיד על הכלאה נאותה בעוצמות בדיקה.
טבלה 1: סיכום קבוצה
| דוגמאות | קבוצה | מין | גיל | PMI |
| C1 | CONTROL | F | 79 | 15.00 |
| C2 | CONTROL | M | 22 | 21.47 |
| C4 | CONTROL | M | 75 | 20.25 |
| C5 | CONTROL | M | 80 | 15.50 |
| C6 | CONTROL | F | 58 | 21.08 |
| C8 | CONTROL | M | 61 | 17.00 |
| C10 | CONTROL | F | 71 | 20.50 |
| C11 | CONTROL | F | 12.66 | |
| C12 | CONTROL | F | 86 | 6.92 |
| מתכוון | 4M/5F | 69.11 | 16.71 | |
| S1 | SCHIZOPH. | F | 93 | 6.92 |
| S2 | SCHIZOPH. | M | 55 | 21.40 |
| S3 | SCHIZOPH. | F | 67 | 21.80 |
| S4 | SCHIZOPH. | F | 55 | 22.00 |
| S5 | SCHIZOPH. | M | 36 | 17.97 |
| S6 | SCHIZOPH. | M | 62 | 10.75 |
| S8 | SCHIZOPH. | F | 92 | 17.80 |
| S11 | SCHIZOPH. | M | 56 | 21.83 |
| S12 | SCHIZOPH. | F | 88 | 13.33 |
| מתכוון | 4M/5F | 68.11 | 16.90 |
קיצורים: F - נשים, מ - PMI זכר, - רווח שלאחר המוות, schizoph. - סכיזופרניה.
טבלה 2: סיכום תוצאות המתארות RNA, ריכוז האיכות והיעילות הכלאה
| דוגמאות | [MRNA] ng / ul | A260/A280 | בדיקה אינטנסיביות | אחוז קוראים |
| C1 | 1,318.01 | 2.67 | 63 | 19.5 |
| C2 | 2,312.93 | 2.37 | 147 | 30.6 |
| C4 | 1,811.92 | 2.44 | 69 | 26.6 |
| C5 | 1,316.26 | 2.51 | 78 | 34.7 |
| C6 | 1,663.24 | 2.39 | 66 | 33.8 |
| C8 | 633.05 | 2.54 | 101 | 15.2 |
| C10 | 1326.4 | 2.47 | 92 | 32.5 |
| C11 | 994.24 | 2.75 | 76 | 22.4 |
| C12 | 817.23 | 2.7 | 56 | 15.2 |
| S1 | 2,560.88 | 2.47 | 78 | 25.0 |
| S2 | 2,169.61 | 2.43 | 76 | 26.5 |
| S3 | 2,067.32 | 2.52 | 87 | 22.1 |
| S4 | 1,563.89 | 2.75 | 82 | 28.1 |
| S5 | 2,071.44 | 2.44 | 88 | 28.2 |
| S6 | 2,532.59 | 2.34 | 72 | 30.7 |
| S8 | 2,189.22 | 2.5 | 62 | 31.8 |
| S11 | 1,669.89 | 2.47 | 41 | 27.3 |
| S12 | 1,739.35 | 2.47 | 42 | 28.0 |
| מתכוון | 1,708.75 | 2.51 | 76.44 | 26.57 |
איור 1:. סיכום של תהליך לייזר ללכוד את microdissection) עצב פירמידליים מזוהים מורפולוגית. ב) לאחר לייזר יש פעמו דרך הסרט תרמופלסטיים, התאים לדבוק כובע ולכן הם כבר לא בשקופית, משאיר מאחורי הרקמה שמסביב. ג) Photomicrograph של אוכלוסייה הומוגנית תא שמירה על שווי CapSure לייזר לאחר לכידת.
איור 2:. RNA סך לשלוט באיכות A + B) מייצג RNA באיכות טובה לאחר בידוד מוחלט, בעוד ג + ד) ממחישה מה RNA סה"כ לא צריך להיראות כמו אחרי בידוד. א) electropherogram עם פסגות 18/28S ברור להתכתב עם הג'ל וירטואלי (B). ג) electropherogram מראה שטח גדול מתחת לעקומה ואין פסגות 18S/28S המציין השפלה RNA. זו מוצגת גם הג'ל וירטואלית (ד ').
איור 3:. בקרת איכות mRNA A + B) Electropherogram (א) ו וירטואלי ג'ל (ב ') המציין את תעתיק mRNA Lengה (התפשטות) יש צורך ללימודי microarray, כלומר הארכת בעבר 600 נוקלאוטידים (NT). ג + ד) Electropherogram (C) וירטואלי ג'ל (ד ') מראה מה להפיץ mRNA מספיק תיראה, כמו אורך תעתיק mRNA לא להאריך 200nt האחרונות.
Discussion
כאן, אנו מנסים להתאים אישית את פרוטוקול לחלץ אוכלוסיות תאים הומוגנית מרקמת המוח הטרוגנית שלאחר המוות באמצעות XT ארקטורוס מערכת RNA הקשורות ערכות החילוץ. כפי שתואר לעיל, עשינו כמה שינויים הפרוטוקולים המקוריים המסופקים על ידי החברה, על מנת למקסם את שלמות RNA. לכידת מוצלח של תאים בודדים תלוי אך ורק על אופטימיזציה של צעדים לפני ללכוד מנת להשיג תאים לכל היותר עם RNA טוב. צעדים אלה כוללים את פרמטרים שונים הקשורים רקמות חתך ו מכתים. בקיצור, לגבי הכנת רקמות אלה כוללים: 1) להקטין את שיפוע הטמפרטורה כאשר חתך, 2) רק הצבת 2 סעיפים לכל שקופית, 3) ביצוע כל הצעדים התייבשות על הקרח, 4) להוסיף אינהיביטור RNase על הכתם, 5) הגדלת משך התייבשות אתנול 100% הסופית 3 דקות.
באשר לכידת, אנו חשים כי השילוב של CapSure HS כובעים, עם התוכנה על הגדרת מאקרו, צריך להבטיח תוצאות אופטימליות. סביבת לחות מבוקרת הוא קריטי כדי ללכוד תאים בודדים, כמו לחות גבוהה מפחיתה באופן דרסטי רקמה "להרים". טמפרטורות גבוהות עלולות גם להיות השפעה שלילית על איכות RNA.
במהלך הפרוטוקול בידוד RNA עם ערכת PicoPure, ישנם שני שלבים לשטוף. חשוב לבדוק כי כל חיץ לשטוף יוסר לפני העברת צינור אחר microcentrifuge עבור elution RNA, כמו נוכחות בכל המאגר במדגם הסופי שלך תגרום RNA מתחיל פחות הגברה. כדי להבטיח זאת, אנו צנטריפוגות לשטוף את הצעד הסופי של 2.5 דקות במקום 2 דקות כפי שהוצע בפרוטוקול סיפק.
לרוב, פרוטוקול הגברה ליניארית היה על פי הוראות היצרן. עם זאת, שתי נקודות מכריע צריך להילקח בחשבון בעת שימוש בפרוטוקול זה: 1) לנסות להגביל הפסד של רנ"א באמצעות העברת עודף של דגימות בין צינורות, רק באמצעות הצינורות 0.5ml בתנאי בשיתוף עם בלוק 0.5ml ב Cycler תרמית וכן 2) בעת העברת המדגם לעמודה טיהור לטיהור cDNA, כדי להיות בטוח ספין למטה דוגמיות לאחר ההעברה הראשונה. זה יגרום נוספת 1-2ul המדגם להוסיף עמודה הטיהור ולכן יכולים להגדיל את ההתאוששות cDNA.
כאשר עושים שימוש בערכה סוף תיוג TURBO עבור תיוג-ביוטין של דגימות מוגבל שלך ארנה, אנו מציעים הוספת μl כמה תוספת של מים לפני השלב צנטריפוגה, כדי להגדיל את התשואה RNA שכותרתו שחולצו מן הטור. דקה נוספת של צנטריפוגה יעזור גם בעניין זה, במיוחד אם אתה עובד עם רקמה מושפל, כגון רקמת FFPE.
אנחנו מרגישים בטוחים כי פרוטוקול זה יאפשר למשתמש לבודד מבנים הומוגנית קטנה, כגון אוכלוסיות תא בודד, בתוך רקמת המוח הנתיחה שלאחר המוות הטרוגניים. פעולה זו מפחיתה תופעות דילול של מבנים הסמוכים ושאר סוגי תאים הנמצאים בשכבות שונות בתוך המוח, מוביל לתוצאות ממוקדות כלפי סוגי תאים מסוימים תחת חקירה. כמו איכות RNA המתקבל הוא מספיק טוב בשביל מחקרים microarray, אנו יכולים להתחיל להצביע חתימות מולקולריים ספציפיים של אוכלוסיות תאים ספציפיים מושפע המחלה מדינות.
Disclosures
ההפקה של המאמר וידאו זה היה בחסות החיים טכנולוגיות.
Acknowledgments
בהכרת תודה אנו מודים התקנים מולקולריים בטכנולוגיות אנליטיות / ארקטורוס על התרומה הנדיבה של חומרים כימיים המשמשים למחקר. כמו כן, אנו מודים מרכז המשאבים הרווארד רקמות למתן רקמה אנושית המוות המוח מימון:. RO1MH76060 ו P50MH080272.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4.5” Forceps | VWR international | 82027-392 | |
| Arcturus XT™ Laser-Capture Microdissection (LCM) System | MDS Analytical Technologies | 13821-00 | |
| CapSure™ HS LCM Caps | MDS Analytical Technologies | LCM 0214 | |
| CapSure® Macro LCM Caps | MDS Analytical Technologies | LCM 0211 | |
| Experion™ Automated Electrophoresis Station | Bio-Rad | 700-7001 | |
| Experion™ RNA HighSens Chips | Bio-Rad | 700-7155 | 10 chips |
| Experion™ RNA HighSens Reagents | Bio-Rad | 700-7156 | 10 chips |
| Experion™ RNA StdSens Chips | Bio-Rad | 700-7153 | 10 chips |
| Experion™ RNA StdSens Reagents | Bio-Rad | 700-7154 | 10 chips |
| Falcon® polypropylene Conical tube | BD Biosciences | 352070 | |
| GeneAmp® thin-walled reaction tube with domed cap | Applied Biosystems | N8010611 | |
| GeneChip® Human X3P array | Affymetrix | 900516 | 6 chips |
| Histogene® LCM Frozen Section Staining kit | MDS Analytical Technologies | KIT0401 | For staining solution, jars, ethanols and Xylene |
| Histogene™ LCM slides | MDS Analytical Technologies | 12231-00 | |
| Micro Slide Box | VWR international | 48444-004 | |
| Microm HM 505E cryostat | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 22-050-350 | Catalogue number for similar product as current product no longer available |
| Microprocessor Controlled 280 series Water bath | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 51221048 | Model 282 |
| Molecular Sieve | EMD Millipore | MX1583L-1 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Inc. | n/a | The NanoDrop 1000 is not available anymore, but the NanoDrop 2000 is comparable. |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9932 | |
| PEN Membrane glass slides | MDS Analytical Technologies | LCM 0522 | |
| PicoPure® RNA Isolation kit | MDS Analytical Technologies | KIT0204 | |
| RiboAmp®HSPLUS with Biotin labeling | MDS Analytical Technologies | KIT0511B | 12 reactions Includes TURBO biotin labeling™ kit |
| RNase Zap® | Ambion | AM9780/2 | |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| RNasin® Plus | Promega Corp. | N261B | |
| SuperScript™ III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18080-044 |
References
- Imbeaud, S., Graudens, E., Boulanger, V., Barlet, X., Zaborski, P., Eveno, E., Mueleer, O., Schroeder, A., Auffray, C. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Res. 33, e56-e56 (2005).
