Summary
Biz postmortem insan beyni superior temporal girus III. Tabakası homojen bir hücre popülasyonu, piramidal nöronlar, RNA izole etmek ve ayıklamak için lazer yakalama mikrodiseksiyon kullanarak bir süreci tanımlar. Biz (T7 tabanlı) mRNA daha sonra doğrusal yükseltmek. Kullanmakta olduğunuz örnek Affymetrix insan X3P mikroarray melezleşme.
Abstract
Biz tabaka III piramidal nöronların gen ekspresyon profilleri sorgulayarak, şizofreni hastalarında görülen superior temporal girus gri cevherde azalma araştırmak için önerdi. Serebral korteks, farklı bölgelerde, katmanlar ve hücre tipleri, her biri farklı hücresel ve moleküler kompozisyon ve bu nedenle diferansiyel gen ekspresyon profilleri ile karakterize oluşan son derece heterojen bir yapısı olduğu bilinmektedir. Doku heterojenliğin karıştırıcı etkilerini aşmak için, belirli bir hücre tipi yani piramidal nöronlar izole etmek için lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) kullanılır.
Histogene boyama solüsyonu ile boyanmış yaklaşık 500 piramidal nöronlar Arcturus XT LCM sistemini kullanarak ele geçirildi. RNA daha sonra yakalanan hücreleri izole ve iki tur T7 tabanlı doğrusal amplifikasyon Arcturus / Moleküler Cihazlar kitleri kullanılarak uygulandı. Experion LabChip (Bio-Rad) jel ve Elektroferogram mikroarray'ler için gerekli geçmiş 600nt uzanan bir transkript uzunluğu ile, kaliteli bir (m) RNA belirtilir. 2.5 A260/280 oranı, belirtildiği gibi, elde edilen mRNA miktarı kabul edilebilir ortalama örnek saflıkta, 51μg ortalama. Gen ekspresyonu Affymetrix İnsan X3P GeneChip prob dizi ile profilli oldu.
Protocol
1) Doku kesit:
Biz yaş, cinsiyet ve postmortem aralığı (PMI) (Tablo 1) açısından eşleştirilmiş, Harvard Beyin Dokusu Kaynak Merkezi'nden gerekli doku (kontrol n = 9, şizofreni n = 9) elde etti. Sıvı azot buharı blokları yaklaşık 3mm kalınlığında Brodmann Kullanıcı alanda 42 (superior temporal girus) alınmıştır.
Piramidal nöronlar boyama başlamadan önce, koşulların en uygun doku "lift" ve yüksek RNA kalitesi elde etmek için optimize edilmesi gerekir. Doku "lift" yakalamak için işaretlenmiş nöronlar kap yapışır ve kalan doku geride ayrılır süreci, lazer yakalama mikrodiseksiyon sırasında açıklanmıştır.
Optimizasyon:
- RNA kalitesinden ödün RNaz etkinliğini azaltmak,% 100 etanol ile silerek ek RNaz Zap gibi bir RNaz dekontaminasyon solüsyonu ile bıçak ve slaytlar kesit çalışma alanı, de dahil olmak üzere tüm yüzeylerde, tedavi için.
- -17 Ayarlanır Kriyostat Bölüm doku ° C. Bu oda sıcaklığında (kaydıraklı), Kriyostat ve kuru buz (bkz. aşağıda tüm süreci) arasındaki sıcaklık farkı azaltır. Sıcaklık -20 ° C altında ise, doku kesitlerinde, bunları kullanılmaz hale getirmekteydi parçalamak eğilimindedir. RNA bütünlüğünü tehlikeye düşürebilecek, yüksek ve sıcaklık farkı artar.
- Bölümleri kalın bölümleri sonuçta doku "asansör" uzlaşma olacak gibi, 8μm kalın olmalıdır. Bu kalınlığı da yakalamak için piramidal nöronlar doğru belirlenmesini sağlar.
- Lazer yakalama işlemi sırasında doku "lift" ile karışmaz bu gibi düz yüksüz cam slayt (örneğin Histogene LCM slaytlar) kullanın. Membran slaytlar da kullanılır, ancak membran böylece kızılötesi (IR) lazer spot büyüklüğü artan ve azalan hücre özgüllüğü, lazer yakalama işlemi sırasında hafifçe kaldırmak için eğilimi bu, büyük doku yapıları izole etmek daha uygundur olabilir.
- Kesit alma işlemi sırasında sıcaklık slayt başına en fazla iki bölüm RNA kalitesini sürekli değişim nedeniyle tehlikeye atabilecek gibi, cam slayt başına iki bölüme monte edin.
- Kesit sonra, RNA bütünlüğünü korumak için kuru buz üzerinde bir mikro slayt kutuya slaytlar hemen. Işlenmiş ° C kadar beynin bölümleri içeren Slayt kutuları daha sonra -80 saklanır.
Biz daha önce piramidal nöronlar için, vaka başına 500 hücre mikroarray hibridizasyon için yeterli RNA elde etmek için yeterli olduğunu tespit ettik. Yaklaşık dört bölümden nedeniyle, kesit ve boyama eserleri, vaka başına ihtiyaç vardır.
2) piramidal nöronlar Boyama:
Bize sulu çözeltiler uzun süre maruz kalmadan, böylece RNA koruyarak, bu nöronların görselleştirmek için piramidal nöronların belirlenmesi, Histogene hızlı boyama çözüm ve kit ile elde edilir.
- RNaz faaliyet sınırlamak amacıyla boyama çözüm (örneğin Promega) 100μl başına 1μl RNaz inhibitörü ekleyerek boyama işlemi için hazırlayın. Dört bölümden (2 kaydıraklı), RNaz inhibitörü 4μl gerektiren bir 1.5ml mikrosantrifüj tüp (buz üzerinde tutulmalıdır) Histogene boyama çözüm 400μl eklendi. Her bölüm için, biz bu çözüm, piramidal nöronlar tanımlamak için bize yeterli bir leke verir 97μl kullanın.
- Histogene kiti, yani 2x75%,% 95,% 100 ve 2 kavanoz RNaz ücretsiz su ile sağlanan boyama kavanoz içine uygun ethanols kısım 25ml: Dehidratasyon serisi ve ksilen hazırlayın. -20 ° C derin dondurucuda% 75 kavanoz, kavanoz dışında, bir buz kovası tüm yerleştirin. Davlumbaz altında, aşırı su, doku, "asansör" tehlikeye atabilecek kaldırmak için moleküler elekler Ksilen kavanoza ekleyin.
- 42 ayarlanan sıcaklık ile su banyosunda (veya ısı bloğu) açın ° C su banyosunda bir raf tarafından desteklenen bir 50 ml Falcon tüp yerleştirin.
- -80 Iki slaytlar çıkarın slaytlar köşelerinde defrost başlayana kadar sadece ° C ve defrost onları yaklaşık 30 saniye boyunca bir KimWipe, ya da.
- Kısaca, -20 ° C derin dondurucuda 30 saniye boyunca% 75 etanol slayt düzeltin. RNaz-zapped forseps kullanarak kirliliği azaltmak için boyama kavanoz arasındaki slaytları aktarın.
- Nükleaz serbest su 30 saniye yıkama sonra, bölümleri düz cam slayt Ancak bu kesinlikle gerekli değildir, çözüm bölümünde odaklanabilmek için bir PAP bariyer kalem ile özetlenen olabilir.
- Bölüm başına leke / RNaz inhibitörü 97μl, 20 saniye boyunca Histogene boyama solüsyonu ile dört bölümden Leke. Daha sonra, adım başına 30 saniye boyunca buz üzerinde önceden hazırlanmış ethanols bölümleri kurutmak. Son% 100 etanol adım 3 dakika uzatılmalıdırYeterli doku "asansör" için yeterli dehidratasyon ulaşmak ve LCM kapaklar üzerine yakalamak için.
- Yakalamak için önce başka bir 5 dakika için bir duman kaputu 5 dakika kurumasını Ksilen slaytları bırakın.
Hemen sonra lazer yakalama eğer boyama adımları sadece yapılmalıdır. Tüm çözümler bulaşmasını önlemek için uygun dehidratasyon sağlamak için her 4-6 slaytlar değiştirilmesi gerekir.
3) Tek hücre lazer yakalama mikrodiseksiyon:
Arcturus XT sistemi ve yazılımı ile boyandıktan sonra, tabaka III piramidal nöronlar, lazer yakalama mikrodiseksiyon kullanarak kaldırılır. Kısaca, filmin ilgi hücreler üzerine doğrudan uzantısı / distansiyon ile sonuçlanan, bir kap tabanı bulunan bir termoplastik film aracılığıyla ayarlanabilir bir gücü IR lazer darbe sistemi çalışır. Kap doku kaldırıldığında, hücrelerin kapağı esir / tutsak kalır. Resimsel bir özeti Şekil 1'de verilmiştir.
Bu yordama başlamadan önce, bu sistem ile mevcut kapakların iki tip ayırt etmek önemlidir. Makro CapSure kap genellikle daha büyük dokuların yapıları yakalamak için kullanılan iken, CapSure HS kapakları tek tek hücrelerin az sayıda yakalamak için tasarlanmış ve bu nedenle bu kapaklar yakalamak için belirlenen küçük bir yüzey alanı vardır. Makro kap değildir HS kapakları da doku bölümü ile doğrudan temas halinde olan kap önlemek raylar var. Bu raylar Makro kapağı katlanmış, düzensiz doku doğrudan oturur gibi spot büyüklüğü değişkenliği (lazer pulse) etkileyebilir ya da neden olabilir doku katlama etkisini azaltmak. Prosedür için, HS kapakları doku katlama etkisini azaltmak için yeteneklerini yararlanmak için kullanılır, ama biz büyük bir hücre sayısı yakalama yakalanan alanını maksimize etmek için yazılım Makro kap ayarları tutulur.
- Arcturus XT aparat üzerine slaytlar ve kapaklar yükleyin. CapSure HS kapaklar kullanın, ancak Makro program ayarı tutmak. Her bir slayt genel bir fotoğraf elde etmek için bir bakış ile "Load" kutusunu tıklayın.
- Bölümde lazer yakalama için optimal olacağını belirlemek için, 2x büyütme parlaklık / odağı ayarlayın. Aşırı kıvrımlı doku kesitlerinde kaçının değil, düzgün, sağlam ve özellikle ilgi yani katman III bölgenin yakın, iyi boyanmış bölümleri seçin.
- Daha sonra genel alan üzerinde tabaka III, emin çekmek, olacak bir kap yerleştirin. Hala 2x büyütme, kap raylar, bu kap eğim olarak herhangi bir kıvrım dinlenmek yok olduğunu emin olun.
- Sonra, 40x büyütme el IR lazer spot yerini onaylayın. Spot (kırmızı kiriş) mavi haç ile ilişkili değilse, bu nokta üzerinde sağ tıklayarak ve "yer IR nokta" seçimi ayarlanabilir.
- 40x, piramidal nöronlar aşağıdaki kriterlere göre tespit başlar (1) şeklinde piramidal ve (2) apikal ve / veya bazal dendritler proksimal kısmı (Şekil 1A) tanımlanabilir hücreleri.
Şimdi piramidal nöron yakalamak için lazer darbe gücü ve süresi ayarlayın. Yakalanan hücrelerinin sayısına ek olarak yakalanan hücrenin özgüllüğünü belirler Bu, özellikle önemlidir. Nabız çok zayıf nabız çok güçlü ise sadece nöron başka doku / hücre çevreleyen yakalamak ise tüm tespit nöronlar, Çekilecek. Genel olarak, burada istihdam edilen doku ve hücre özellikleri ile, yaklaşık piramidal nöron büyüklüğü ile paralel olarak lazer gücü (70mW) ve bir spot büyüklüğü 25μm süresi (16msec) sonucu (Şekil 1B). Ancak, bu ayarlar vaka başına kabaca aynı spot büyüklüğü elde etmek için her bölüm için ince ayar. "Lift" ele geçirilirse, bir RNA miktarını karşılaştırılabilir Her iki durumda elde tutmak için her zaman yakalanan hücrelerinin sayısını artırabilir. Ancak, emin olun, 1.5 saatin altında boyama dahil olmak üzere, yakalama zamanı tutmak için daha uzun RNA kaliteden ödün.
- İlk position işlevi artı işaretini tıklayarak kapağın konumunu kaydedin. Bu sayede herhangi bir nedenden dolayı kapağı kaldırmak ve daha sonra aynı yere geri koymak gerekir gerekir, kapağı her zaman için nokta boyutu ayarlanabilir tam olarak aynı noktaya dönecektir.
- Süresi içinde güç ve 16: 70 kontrol kutusu içine aşağıdaki değerleri girin. Unclick "otomatik hareket aşaması" seçeneği ve doğru büyüklükte sembolü sağ panelde sembolü ile ilişkilidir emin olun.
- Yakalamak test etmek istediğiniz bir nöron seçmek için (sağ altta), daire seçeneği seçin ve ardından tıklayarak lazer etkinleştirmek"test IR spot".
- Öncelikle lazer tarafından yapılan yerinde yakalanan nesnenin etrafında keskin koyu bir halka sahip olmalıdır. Bu halka çok açık ise, hücre yakalanan değildi. Karanlık halkanın ortasında karanlık bir nokta varsa, o zaman lazer gücü / süre çok büyük, ve yakalanan hücre RNA hediyesi üzerinde olumsuz bir etkisi olabilir. Halka hücre kapsayacak kadar büyük, ancak istenmeyen doku veya diğer hücreleri içermez kadar küçük olduğundan emin olun.
- Spot büyüklüğü, bulunduğu yere bağlı olarak farklılık olmadığını kontrol etmek, yakalamak istediğiniz katmanı içinde farklı doku parçaları üzerinde bu işlemi tekrarlayın. Buna göre yapın.
- Lazer nokta ayarlandıktan sonra, yakalama piramidal nöronlar belirlemeye devam. Biz, örnek başına toplam RNA yaklaşık 500pg sonuçları örnek başına yaklaşık 500 hücre, tanımlar. Biz de genellikle sadece kap her bölüm için yeniden ayarlanması gibi, yakalama zaman miktarını azaltmak için bir bölüm kullanın. Bir kez, size gerekli olan tüm hücreleri tespit lazer yakalama düğmesine basın ve tüm hücreleri otomatik olarak kapağı (Şekil 1C) üzerine Çekilecek.
- Tüm hücreleri yakalanan sonra, bir bölüm içermeyen slayt farklı bir kısmını kap taşıyın. Hücreleri nerede çekildiğini geri dönün ve nöronların en az% 90 kaldırılmış olduğundan emin olun. Eğer değilse, aynı hücrelere yeniden ele geçirmek için çalışın, ancak hücreleri en çok, ele geçirildi alan bulmak, aynı bölgede daha fazla hücre yakalamak yoktur. Kap QC istasyonuna hareket ettirin.
- Applied Biosystems (kat. # N8010611) 50ml (PicoPure RNA İzolasyon kiti) ekstraksiyon tamponu içeren 0.5 ml mikrosantrifüj tüp kap yerleştirin. Kap, tampon sızmasını önlemek için bu özel bir tüp içine mükemmel uyum sağlayacak şekilde dizayn edilmiştir.
- Ekstraksiyon tamponu tüm kapağını kaplayan emin yapım, montaj baş aşağı çevirin ve su banyosunda set zaten mevcut 50 ml Falcon tüp 42 ° C'nin altındaki Nöronlar doku kapağı kaldırmak için 30 dakika inkübe edilir.
- Bundan sonra, tüp ve kap montaj 800 g az 2 dakika süreyle santrifüj. Kapağı çıkarın ve kalan hücre özü saklamak -80 ° C, RNA ekstraksiyon kadar. Ekstra bir önlem olarak, bütün nöronlar kapağını kendisi çıkarıldığından emin olmak için lazer yakalama cihazları QC istasyonunda kap yeniden inceleyebilirsiniz.
4) belirli nöron popülasyonları RNA Edinme:
Bir izolasyon yakalama doğrudan ya da -80 ° C derin dondurucuda saklanan örnek Çözülme. Deneyde, ilk izolasyon RNA geçmeden önce -80 ihtiyaç duyulan ve onları saklanan tüm örnekleri ° C topladı.
LCM örnekleri az sayıda hücreleri izole etmek ve düşük bolluğu mRNA korumak için tasarlanmıştır PicoPure İzolasyon Kiti, RNA izolasyonu kullanılarak yapılır. Genel olarak, kit ile birlikte protokol izleyin. Aşağıda, bu sürecin temel bir açıklama verir.
- Çözündükten sonra RNA sütun filtre bağlamak için% 70 etanol (kit ile birlikte verilen) ve klimalı bir ön arıtma sütun üzerinde santrifüj ekleyin.
- Yıkandıktan sonra, DNA DNA girişim riskini ortadan kaldırmak için tümüyle kaldırılmasını sağlamak amacıyla DNaz RNA tedavi. Bu adım, gerçek-zamanlı QRT-PCR gibi alt uygulamalarda özellikle önemlidir.
- DNA sindirimi takiben, başka bir yıkama adım var. Amplifikasyonu için RNA az başlayan son örnek tampon herhangi bir varlığı neden olarak yıkama tamponu, başka bir mikrosantrifüj tüp aktarmadan önce sütun kalır. Bunu sağlamak için, verilen protokol önerilen 2.5 dakika yerine 2 dakika için son yıkama adım santrifüj.
- Son olarak, elution tampon, total RNA Zehir için 1 dakika santrifüj takip sütun eklenir ve filtre üzerinde inkübe.
- Numunelerin her biri ayrı 0.5 ml tüpler Pipet 1.3ul bir Experion HighSens LabChip çalıştırın. Numunenin geri kalanı Freeze -80 ° C
RNA izole Kalite Kontrol miktarı az olduğu zaman, özellikle, çok önemli ve mikroarray deneyler (15μg) gibi gerekli olan miktar, büyük. Bu nedenle çıkarılan RNA süreci boyunca çeşitli noktalarda kalite kontrolünden geçmek gerekir. Ekstraksiyonu sonrası ilk oluşur. Biz electropherograms ve Experion HighSens LabChip tarafından oluşturulan sanal jel 18S/28S zirveleri brüt sınavı ile toplam RNA bütünlüğünü kurmak. Bu yöntem hızlı ve RNA kalite Elektroferogram ve sanal bir jel (Şekil 2) kontrol etmek için ölçümlerin iki araç sağlar. Toplam RNA kalitesi nispeten daha iyidir (Şekil. 2A, B vs C, D), biz o zaman doğrusal toplam RNA'nın yaklaşık% 2 hesapları mRNA, büyüterek devam.
5) Lineer amplifikasyon:
Lazer yakalanan dokulardan çıkarılan RNA Amplifikasyon RNA sonraki mikroarray hibridizasyon ve QRT PCR deneyler için yeterli miktarda üretmek için gereklidir. T7 tabanlı doğrusal bir amplifikasyon ile dikkat potansiyel boşa olasılığını en aza indirmek için, başlangıç lazer yakalanan doku malzemelerin miktarı maksimize ederek gerekli amplifikasyon tur sayısı en aza indirgenecektir.
Bizim ön veri (gösterilmemiştir) yaklaşık 500 hücre içeren dokuların çıkarılan toplam RNA doğrusal amplifikasyon (RiboAmp HS PLUS kiti) iki tur Arna yaklaşık 50μg üretmek öneririz - mikroarray ve QRT-PCR hem de performans için yeterli deneyler. Mümkünse, örnek, 0.5 ml blok termal cycler ve kitinde 0.5 ml tüpler kullanarak 0.2ml ve 0.5 ml tüpler arasındaki gereksiz transfer kaçının.
Yine takip protokolü kiti ile sağlanan biridir. Kısaltılmış bir versiyonu burada tanımlanmıştır.
- Toplam RNA örneği (yaklaşık 11μl) astar 1μl ekleyin ve 65 inkübe ° C, 5 dakika boyunca 4 ürpertici tarafından takip ° C 'de 1 dakika.
- Üst Simge III Reverse Transcriptase 42 inkübe ° C 1 saat süreyle birlikte ilk iplikçik cDNA bileşenlerini ekleyin.
- Ikinci iplikçik cDNA sentezi sonra, ortaya çıkan arıtma sütun üzerinden sağlanan bir cDNA arındırmak. Transferinden sonra tüplerin tarafta kalır örnek 1μl, sütun için örnek bir kez aktarıldıktan sonra - İşte biz örnek artı bağlayıcı tampon arıtma sütununa aktarırken, iki kez numune tüpleri santrifüj öneririz.
- CDNA yıkama tamponlar ile yıkayın ve saflaştırılmış elüsyon tamponu ile cDNA Zehir.
- In vitro transkripsiyon bileşenleri ekleyin ve 42 az 6 saat boyunca inkübe ° C
- DNaz adımdan sonra, sonunda elüsyon tampon 12μl toplam salınımlı sağlanan tamponlar ile ortaya çıkan Arna arındırmak.
Daha fazla kalite kontrol adımları istihdam sonra, RNA (bkz. kiti protokolü ile ayrı primerler) doğrusal amplifikasyon bir tur uğrar. Bir örnek ul yaklaşık StdSens LabChip (Experion) mRNA transkript uzunluğu ve konsantrasyonunu belirlemek için 250ng/ul seyreltilir. Geleneksel Affymetrix mikroarray teknolojisi mRNA tespit edilmesi amacıyla uzunluğu en az 600 nükleotidler gerektirir. LabChip elde edilen jel ve Elektroferogram bu nedenle, bu minimum mRNA transkript uzunluğu (Şekil 3) tasvir gerekir.
Ek bir kalite kontrol, iki optik yoğunlukları, yani A260 ve A280 oluşan bir oran, RNA saflık belirler NanoDrop spektrofotometre analizi üzerinden tespit edilir. 2.7 'ye oranları karşılaştırılabilir hibridizasyon kalitesine sahip olmasına rağmen 2.1 etrafında bir optik yoğunluk örnekleri, gen ekspresyon analizi için etiketli olmalıdır. Daha düşük (-80 ° C altındaki sıcaklıklarda bile) depolama sırasında bozulması RNA yol açtı ve aynı zamanda kötü mikrodizi sonuçlara yol açmıştır konsantrasyonu da 800ng/μl-1μg/μl arasında olması gerekir.
6) Affymetrix mikroarray analizi için Biotin-etiketleme mRNA örnekleri:
Moleküler Cihazlar TURBO Biotin etiketleme kiti (son etiketleme) amplifiye örneklerinden elde edilen Arna etiketlemek için kullanılır. Protokolün kısaltılmış bir versiyonunu burada verilir.
- Nükleaz içermeyen su ekleyerek veya başlangıç konsantrasyonuna bağlı olarak bir vakum santrifüj örnek konsantre 13μl toplam 20 mikrogram her Arna örnek hacmi ayarlayın. Bazı RNA kuluçka ve santrifüj sırasında kaybolur gibi, biz sadece 15μg kullanılan Affymetrix çip için gerekli olsa da, ilk tepki 20μg ekleyin.
- 4 soğuk sonra 30 dakika süreyle, 85 biotin reaksiyon ° C'de inkübe ° C
- Kiti ile sağlanan özel bir sütun ile santrifüj yoluyla aşırı biotin etiket çıkarın. Bazı durumlarda, özellikle bozulmuş mRNA FFPE (formalin ile fikse, parafine gömülü) örnekleri elde gibi, bu, tek bir santrifüj adımda tüm mRNA yıkandı, bu durumda olabilir. Daha sonra, bir sonraki ekstra 1 dakika santrifüj adım 1-5μl ekstra nükleaz içermeyen su sütun arasında eklemenizi öneririz. Bu etiketli numune en yıkandı, o sağlar.
- Son hacmi 1μg/μl bir konsantrasyon ile, 20μl. Ekstra nükleaz ücretsiz su eklenir ise, örneklerin konsantredoğru bir vakum santrifüj hacmi. Biz bu daha az kötü mikrodizi sonuçlarında çıkan depolama ve / veya hibridizasyon sırasında bozulmalara neden olacağı gibi, 800ng/μl üzerinde hibridizasyon başlamadan önce depolama konsantrasyonu tutmanızı öneririz.
Arna sonra melezleşmiştir ve Affymetrix İnsan X3P GeneChip prob dizi gen ekspresyonu kullanılarak, profilli. Bu çip, daha fazla bozulmuş Arna için tasarlanmış olduğu gibi, bizim kontrol edemediğimiz birçok faktör postmortem doku kalitesini etkileyebilir gibi, bir önlem olarak kullanılır. Laboratuarımızda hibridizasyon için yeterli olanaklara sahip olmadığı için, süreç Ortaklar Genomik Core tesisinde yapıldı.
Temsilcisi Sonuçlar:
1 +2 +3) Doku piramidal nöronları ve lazer yakalama mikrodiseksiyon boyama, kesit:
Yukarıda açıklanan protokol ile iki slaytlar slayt başına dört bölümden sonuçlanması gerekiyor. Her bölüm minimal çatlama, yırtılma ve katlama düzgün olmalıdır. Doğru boyama, leke, yaklaşık 20 koyu lekeli piramidal nöronlar tanıtacak bir piramit şekli ve görünür apikal dendritler boyutu 25μm. Bölüm / durumda en az toplam RNA 500pg başına 700 hücreler CapSure HS Makro ayarları kapaklar, ve her bölüm için lazer güç ve kuvvet doğru ayarı, yaklaşık 500 almalıdır. Yaklaşık 85 -% 100 nöronlar kapağı (Şekil 1) uyacaktır.
4) belirli nöron popülasyonları RNA Edinme:
Açıklandığı gibi toplam RNA izolasyonu sonra, Bio-Rad Experion üzerinden bir Elektroferogram ve sanal jel vasıtasıyla RNA kalitesini kontrol edin. Elektroferogram, 18S ve 28S ribozomal RNA birimleri karşılık gelen iki ayrı doruklarına göreceksiniz. Postmortem doku ile doku faktörler nedeniyle önce kesit bozulabileceği gibi, ancak bu her zaman böyle değildir. Normalde, etrafında büyük bir tepe, 18S ve daha küçük bir 28S tepe (Şekil 2A, B), büyük bir yumru belirten bozulması göreceksiniz. Sürece Elektroferogram profilleri örnekleri arasında karşılaştırılabilir, hem de RT-PCR ve mikroarray çalışmaları (Imbeaud ve ark, 2005) gerçekleştirmek için yeterli mRNA kalitesi sonucu bu kılavuzda bulduk.
Çok fazla bozulma varsa - Elektroferogram eğrinin altında geniş bir alana tarafından belirtildiği üzere, ya da zirveleri görünür değilse (Şekil 2C ve D) - doku hücreleri tekrar yakalanan olmalıdır. Ayrıca RNA bölümü (sadece hücreleri) tüm parçaları çıkarılan doku kazıma testi, hücrelerin doku blok kendisi bozulmuş olup olmadığını belirlemek için recapturing önce yapmanızı tavsiye ederim.
5) Lineer amplifikasyon:
Lineer amplifikasyon iki tur sonra mRNA kalitesini test etmek için, Bio-Rad Experion StdSens LabChip ve NanoDrop spektrofotometre yaptı. Geleneksel Affymetrix mikroarray teknolojisi mRNA, bu protokol ile elde edildi tespit edilmesi uzunluğu en az 600 nükleotidler için, gerektirir. Aslında, mRNA uzunlukları 1000 nükleotid aralığı tespit edildi. Elektroferogram büyük zirveleri, zamanın bir fonksiyonu (Şekil 3A, B) olarak yavaş yavaş azalan bu yansıtmaktadır.
NanoDrop okuma yaşayabilir mRNA (Tablo 2) gösteren A260/A280 oranı ortalama 2,5, örnekler arasında gösterdi.
Bizim sonuçlarımız, bu protokol ile, elde edilen RNA hem nitelik Affymetrix insan X3P GeneChip ile gen ekspresyon farklılıkları sorgulamak için yeterli olduğunu göstermektedir.
6) Affymetrix mikroarray analizi için Biotin-etiketleme mRNA örnekleri:
Affymetrix insan X3P GeneChip hibridizasyon sonra,% 26.6 (Tablo 2) ortalama yüzde aramaları yeterli hibridizasyon ve prob şiddetleri belirten elde etti.
Tablo 1: Kohort özet
| Örnekler | Grup | Seks | Yaş | PMI |
| C1 | KONTROL | F | 79 | 15,00 |
| C2 | KONTROL | M | 22 | 21,47 |
| C4 | KONTROL | M | 75 | 20,25 |
| C5 | KONTROL | M | 80 | 15,50 |
| C6 | KONTROL | F | 58 | 21,08 |
| C8 | KONTROL | M | 61 | 17,00 |
| C10 | KONTROL | F | 71 | 20,50 |
| C11 | KONTROL | F | 12,66 | |
| C12 | KONTROL | F | 86 | 6,92 |
| ORTALAMA | 4M/5F | 69,11 | 16,71 | |
| S1 | Şizofreni. | F | 93 | 6,92 |
| S2 | Şizofreni. | M | 55 | 21,40 |
| S3 | Şizofreni. | F | 67 | 21,80 |
| S4 | Şizofreni. | F | 55 | 22,00 |
| S5 | Şizofreni. | M | 36 | 17,97 |
| S6 | Şizofreni. | M | 62 | 10,75 |
| S8 | Şizofreni. | F | 92 | 17,80 |
| S11 | Şizofreni. | M | 56 | 21,83 |
| S12 | Şizofreni. | F | 88 | 13,33 |
| ORTALAMA | 4M/5F | 68,11 | 16,90 |
Kısaltmalar: F-kadın, M - Erkek, PMI - postmortem aralığı, şizofreni. - Şizofreni.
Tablo 2: RNA konsantrasyonu, kalite ve hibridizasyon verimliliğini gösteren sonuçlarının özeti
| Örnekler | [MRNA] ng / ul | A260/A280 | Prob Yoğunluğu | Yüzde çağrı |
| C1 | 1318,01 | 2,67 | 63 | 19,5 |
| C2 | 2312,93 | 2,37 | 147 | 30,6 |
| C4 | 1811,92 | 2,44 | 69 | 26,6 |
| C5 | 1316,26 | 2,51 | 78 | 34,7 |
| C6 | 1663,24 | 2,39 | 66 | 33,8 |
| C8 | 633,05 | 2,54 | 101 | 15,2 |
| C10 | 1326,4 | 2,47 | 92 | 32,5 |
| C11 | 994,24 | 2,75 | 76 | 22,4 |
| C12 | 817,23 | 2,7 | 56 | 15,2 |
| S1 | 2560,88 | 2,47 | 78 | 25,0 |
| S2 | 2169,61 | 2,43 | 76 | 26,5 |
| S3 | 2067,32 | 2,52 | 87 | 22,1 |
| S4 | 1563,89 | 2,75 | 82 | 28,1 |
| S5 | 2071,44 | 2,44 | 88 | 28,2 |
| S6 | 2532,59 | 2,34 | 72 | 30,7 |
| S8 | 2189,22 | 2,5 | 62 | 31,8 |
| S11 | 1669,89 | 2,47 | 41 | 27,3 |
| S12 | 1739,35 | 2,47 | 42 | 28,0 |
| ORTALAMA | 1708,75 | 2,51 | 76,44 | 26,57 |
Şekil 1: lazer yakalama mikrodiseksiyon sürecinin özeti.) Piramidal nöronlar morfolojik olarak tanımlanır. B), lazer termoplastik film ile darbeli sonra hücrelerin kap uymak ve çevresindeki doku geride bırakarak, bu nedenle slayt artık. C) homojen bir hücre popülasyonu yüzey elde lazer ele geçirdikten sonra CapSure Cap üzerine yapışmış.
Şekil 2: Total RNA kalite kontrol A + B C + D) total RNA izolasyonu sonra gibi görünmüyor ne gösteriyor iken), izolasyon sonra iyi kalitede toplam RNA temsil eder. A) (B) sanal bir jel ile ilgili net 18/28S doruklarına Elektroferogram. C) Bir Elektroferogram eğrinin altında geniş bir alana gösteren ve RNA bozulma gösteren hiçbir 18S/28S doruklarına. Bu aynı zamanda sanal jel (D) gösterilir.
Şekil 3: mRNA kalite kontrolü A + B) Elektroferogram (A) ve sanal jel (B) gösteren mRNA transkript lengmikroarray çalışmaları için gerekli inci (yayılma), yani son 600 nükleotidler (nt) uzanır. C + D) Elektroferogram (C) ve mRNA transkript uzunluğu olarak geçmiş 200nt uzamaz gibi yetersiz bir mRNA yayılmasını görüneceğini gösteren sanal jel (D).
Discussion
Burada, Arcturus XT sistemi ve ilgili RNA ekstraksiyon kitleri kullanarak heterojen postmortem beyin dokusu homojen hücre popülasyonlarının ayıklamak için bir protokol özelleştirmek için çalışırlar. Yukarıda belirtildiği gibi, RNA bütünlüğünü maksimize etmek için, şirket tarafından sağlanan orijinal protokollere bazı değişiklikler yaptık. Tek hücre başarılı yakalama sadece iyi RNA ile maksimum hücreleri elde etmek için yakalamak için önceki adımları optimize bağlıdır. Bu adımlar, doku kesit ve boyama ile ilgili çeşitli parametreler içerir. Kısacası, bu doku hazırlanması konusunda şunlardır: 1), 2 kesit sıcaklık gradyanı azalan) sadece 4 dehidrasyon, buz üzerinde tüm adımları gerçekleştirdikten slayt başına 2 bölüm, 3) yerleştirerek) artan) Leke, 5 RNaz İnhibitörü ekleyerek 3 dakika için son% 100 etanol dehidrasyon süresi.
Ilgili yakalama, biz CapSure HS kapaklar, Makro ayarı yazılımı ile kombinasyonu optimum sonuçlar sağlamak gerektiğini hissediyorum. Nem kontrollü bir ortamda, yüksek nem, doku "asansör" önemli ölçüde azaltır olarak yakalayan tek hücre için çok önemlidir. Yüksek sıcaklıklar da RNA kalitesi üzerinde olumsuz bir etkisi olabilir.
PicoPure kiti ile RNA izolasyonu protokol sırasında, iki yıkama adımlar vardır. Bu RNA yürütülmesi için başka bir mikrosantrifüj tüp aktarmadan önce, tüm yıkama tamponu kaldırıldı olup olmadığını kontrol edin, son örnek tampon herhangi bir varlığı olarak amplifikasyonu için daha az başlangıç RNA neden olacaktır önemlidir. Bunu sağlamak için, verilen protokol önerilen 2.5 dakika yerine 2 dakika için son yıkama adım santrifüj.
Doğrusal amplifikasyon protokolü büyük bir kısmı için, üreticinin talimatlarına göre. Ancak, bu protokolü kullanırken iki önemli noktayı dikkate alınması gerekmektedir: 1) borular arasında, sadece termal cycler 0.5 ml bloğu ile birlikte sağlanan 0.5 ml tüpler kullanarak aşırı örneklerin aktarılması yoluyla RNA kaybının deneyin ve 2) için örnek cDNA arıtılması için arıtma sütununa aktarırken, ilk transferinden sonra örnek tüpler aşağı spin emin olun. Bu arıtma sütun eklemek ve bu nedenle cDNA kurtarma artırabilir örnek bir ek 1 2ul neden olacaktır.
TURBO son etiketleme kiti kullanımı sınırlı Arna örnekleri biotin-etiketlenmesi için yaparken, ekstra bir kaç ul ekleyerek etiketli RNA sütun çıkarılan verimi artırmak, santrifüj adım önce su öneririz. Santrifüj ekstra bir dakika da FFPE doku gibi bozulmuş doku ile çalışıyoruz, özellikle eğer bu konuda yardımcı olacaktır.
Biz bu protokolü, heterojen postmortem beyin dokusu içinde tek bir hücre nüfus, küçük homojen yapılar, izole etmek için kullanıcı sağlayacaktır emin hissediyorum. Bu soruşturma altında özel hücre tipleri doğru hedeflenen sonuçlara yol açan beyin içinde çeşitli katmanlarında bulunan çevreleyen yapılar ve diğer hücre türleri sulandırma etkileri azaltır. Ortaya çıkan RNA kalitesini mikroarray çalışmaları için yeterli olduğu gibi, belirli bir hücre popülasyonlarının hastalık durumlarında etkilenen spesifik moleküler imzaları saptamak için başlayabilir.
Disclosures
Bu video-makale üretim Yaşam Teknolojileri tarafından sponsor oldu.
Acknowledgments
Biz minnetle cömert bağışı için çalışma için kullanılan reaktiflerin Moleküler Cihazlar Analitik teknolojileri / Arcturus kabul etmiş oluyorsunuz. Ayrıca Harvard Doku Kaynağı Merkezi postmortem insan beyin dokusu sağlamak için teşekkür Finansman: RO1MH76060 ve P50MH080272.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4.5” Forceps | VWR international | 82027-392 | |
| Arcturus XT™ Laser-Capture Microdissection (LCM) System | MDS Analytical Technologies | 13821-00 | |
| CapSure™ HS LCM Caps | MDS Analytical Technologies | LCM 0214 | |
| CapSure® Macro LCM Caps | MDS Analytical Technologies | LCM 0211 | |
| Experion™ Automated Electrophoresis Station | Bio-Rad | 700-7001 | |
| Experion™ RNA HighSens Chips | Bio-Rad | 700-7155 | 10 chips |
| Experion™ RNA HighSens Reagents | Bio-Rad | 700-7156 | 10 chips |
| Experion™ RNA StdSens Chips | Bio-Rad | 700-7153 | 10 chips |
| Experion™ RNA StdSens Reagents | Bio-Rad | 700-7154 | 10 chips |
| Falcon® polypropylene Conical tube | BD Biosciences | 352070 | |
| GeneAmp® thin-walled reaction tube with domed cap | Applied Biosystems | N8010611 | |
| GeneChip® Human X3P array | Affymetrix | 900516 | 6 chips |
| Histogene® LCM Frozen Section Staining kit | MDS Analytical Technologies | KIT0401 | For staining solution, jars, ethanols and Xylene |
| Histogene™ LCM slides | MDS Analytical Technologies | 12231-00 | |
| Micro Slide Box | VWR international | 48444-004 | |
| Microm HM 505E cryostat | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 22-050-350 | Catalogue number for similar product as current product no longer available |
| Microprocessor Controlled 280 series Water bath | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 51221048 | Model 282 |
| Molecular Sieve | EMD Millipore | MX1583L-1 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Inc. | n/a | The NanoDrop 1000 is not available anymore, but the NanoDrop 2000 is comparable. |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9932 | |
| PEN Membrane glass slides | MDS Analytical Technologies | LCM 0522 | |
| PicoPure® RNA Isolation kit | MDS Analytical Technologies | KIT0204 | |
| RiboAmp®HSPLUS with Biotin labeling | MDS Analytical Technologies | KIT0511B | 12 reactions Includes TURBO biotin labeling™ kit |
| RNase Zap® | Ambion | AM9780/2 | |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| RNasin® Plus | Promega Corp. | N261B | |
| SuperScript™ III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18080-044 |
References
- Imbeaud, S., Graudens, E., Boulanger, V., Barlet, X., Zaborski, P., Eveno, E., Mueleer, O., Schroeder, A., Auffray, C. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Res. 33, e56-e56 (2005).
