Summary
We presenteren een
Abstract
Membraanfusie is een essentiële stap tijdens het invoeren van envelop-virussen in cellen. Conventionele fusie assays meestal over een groot aantal van fusie gebeurtenissen, waardoor het moeilijk kwantitatief te analyseren van de volgorde van de betrokken moleculaire stappen. Hebben we een in vitro, twee-kleuren fluorescentie assay om kinetiek van enkele virusdeeltjes fusing-monitor met een doel bilaag in hoofdzaak op vloeistof te ondersteunen.
Influenza virusdeeltjes worden geïncubeerd met een groene lipofiel fluorofoor aan het membraan en een rode hydrofiele fluorofoor aan de virale interieur vlek vlek. We hebben een ganglioside-bevattende lipide bilaag afzetting op de dextran-functionilized glazen oppervlak van een flow cel, incubeer de virale deeltjes op de vlakke bilaag en het imago van de fluorescentie van een 100 x 100 micrometer 2-gebied, met daarin enkele honderden deeltjes, op een CCD camera. Door beeldvorming zowel de rode en groene fluorescentie, kunnen we tegelijkertijd toezien op het gedrag van het membraan kleurstof (groen) en de waterige inhoud (rood) van de deeltjes.
Bij het verlagen van de pH op een waarde onder de fusie pH-waarde, zullen de deeltjes fuseren met het membraan. Hemifusion, de samenvoeging van de buitenste folder van de virale membraan met de buitenste folder van het doelwit membraan, wordt zichtbaar als een plotselinge verandering in de groene fluorescentie van een deeltje. Bij de daarop volgende fusie van de twee overgebleven distale folders een porie zal worden gevormd en de rode-emitterende fluorofoor in het virale deeltje zal worden vrijgegeven onder de doelgroep membraan. Dit evenement zal aanleiding geven tot een daling van de rode fluorescentie van individuele deeltjes. Ten slotte is de geïntegreerde fluorescentie van een pH-gevoelige fluorofoor dat is ingebed in het doel membraan rapporten over de exacte tijd van de pH-daling.
Van de drie fluorescentie-tijd sporen, kunnen alle belangrijke gebeurtenissen (pH-daling, lipide mengen op hemifusion, content mixen op poriën vorming) nu worden gewonnen op een eenvoudige wijze en voor elk deeltje afzonderlijk. Door het verzamelen van de verstreken tijd voor de verschillende overgangen voor veel individuele deeltjes in histogrammen, kunnen we de levens van de bijbehorende tussenproducten. Zelfs verborgen tussenproducten die niet beschikken over een directe fluorescerende waarneembare kunnen direct worden gevisualiseerd uit deze histogrammen.
Protocol
Glazen afdekplaat slip functionalisering
De vlakke dubbellaag gebruikt in de fusion-test wordt ondersteund op een gehydrateerde film van dextran. Dextran fungeert als een spacer tussen de vlakke bilaag en glazen oppervlak. Dit voorkomt dat membraan componenten van steeds vast op het glas oppervlak en biedt ook ruimte aan waarin de inhoud van een virusdeeltje kan ontsnappen na fusie. Dekglaasjes worden gefunctionaliseerd door middel van een behandeling met een epoxy silaan, die ons in staat stelt om chemische binding dextran aan het glas (Elender, et al.. 1996).
- Schik 25 mm dekglaasjes in een keramische vlekken rack, en plaats het rek in een pot of beker.
- Vul de container met een 10% oplossing van laboratorium kwaliteit glaswerk wasmiddel. Plaats de container in een ultrasone reiniger voor 30 minuten.
- Spoel de container en dekglaasje rek met gedeïoniseerd water, en opnieuw vullen met 1M postassium hydroxide. Zet de container naar het bad ultrasoonapparaat nog 30 minuten.
- Herhaal deze reiniging met behulp van aceton en ethanol.
- Spoel de coverlips in het water en droog.
- Ten slotte is het reinigen van de dekglaasjes met een zuurstof plasma stripper voor drie minuten.
- De laatste reiniging stap oxideert het oppervlak, waardoor het glas gelijkmatig hydrofiele en reactief in de volgende silanisatie stappen.
- Bereid een 0,2% oplossing van 3-glycidoxypropyltrimethoxy silaan in isopropanol. Dompel de dekglaasjes in deze oplossing gedurende vijf minuten.
- Gooi de silaan-oplossing en spoel de dekglaasjes meerdere malen in isopropanol.
- De dekglaasjes zijn nu bedekt met een laagje silaan, maar ze moeten worden genezen, zodat de silaan om covalent hechting aan het glas. Plaats de dekglaasjes in een oven op 80 graden Celsius gedurende een uur.
- Terwijl de dekglaasjes worden genezen, wegen uit dextran 500 en bereiden een 30% w / v oplossing. Voorverwarming van het water zal helpen oplossen. Wij zullen ongeveer 1 ml van deze oplossing per dekglaasje aan. Zodra de dextran is opgelost, schuimdemper de oplossing in een vacuüm exsiccator.
- Wanneer de gesilaniseerd dekglaasjes klaar genezen, verwijder ze uit de keramische rek en schik ze plat op de binnenkant van een plastic vriesvakje. Gebruik een 1 ml pipet op de bovenkant van elke dekglaasje met ~ 1 ml van de dextran oplossing te dekken. Sluit de diepvries doos en laat op een rustige plek voor 24-36 uur.
- Pak de dekglaasjes met plastic pincet, giet het overtollige dextran en plaats ze in de keramische rack. Spoel de dekglaasjes meerdere malen in het water, en laat de dekglaasjes in water weken gedurende 48 uur. De pot kan voorzichtig worden geschud op een tafel-top rotator.
- Droog de dekglaasjes in een oven op 80 graden Celsius en op te slaan in een vacuüm exsiccator.
Liposoom Voorbereiding
Ondersteund lipidendubbellagen worden gevormd door adsorberen liposomen om een dextran gefunctionaliseerd dekglaasje aan. De geadsorbeerde liposomen fuseren met elkaar tot de membraan breuken en verspreidt zich vlak boven het oppervlak.
- Een typische liposoom formulering gebruikt in de test bestaat uit 1,2, dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DOPC), 1-oleoyl-2-palmitoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (POPC), cholesterol, runderen hersenen Disialoganglioside (GD 1a), en N-((6 - (biotinoyl) amino) hexanoyl) -1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine in een verhouding van 4:4:2:0.1:5 x10 -5. Alle onderdelen worden opgeslagen in chloroform of chloroform en methanol oplossingen.
- Maak een mengsel dat twee micromol lipide door de overdracht van hoeveelheden van elke component in een glazen reageerbuis. Damp het oplosmiddel onder een stroom van argon of stikstof gas. Verwijder het resterende oplosmiddel door het verlaten van de reageerbuis in een vacuüm exsiccator gedurende twee uur.
- Resuspendeer de gedroogde lipide film in 400 microliter van HNE buffer (5 mM HEPES, 145 mM NaCl, 0,1 mM EDTA).
- Breng de suspensie met een plastic microcentrifugebuis. Bevriezen van de suspensie in een vloeibare stikstof bad en dooi in een warm waterbad. Herhaal deze vries / dooi cyclus vier keer.
- Monteer een lipide extruder met een 100 nm polycarbonaat membraanfilter, en extrusie van de lipide suspensie 25 keer. De schorsing zou moeten verschijnen om een meer transparante na extrusie.
- Liposomen worden gebruikt op de dag dat ze zijn voorbereid. Ze kunnen worden bewaard bij kamertemperatuur tot gebruik.
Microfluïdische stroom celpreparaat
Een eenvoudige microfluïdische stroom cel is gemaakt door daartussen dubbele plakband tussen een kwarts-glijbaan en een gefunctionaliseerd dekglaasje aan.
- Verkrijgen van een 20x20x3 mm kwarts dia. Gebruik een diamant braam tot twee 1 mm gaatjes aan weerszijden boren.
- Snij een 20 mm vierkant van een blad van een dubbele plakband, en het gebruik van een scheermesje, uitgesneden een 15 x 2 mm gedeelte van het centrum.
- Trek een kant van de tape drager, en houden de tape op de kwartz glijbaan. Hechten aan de andere kant om een gefunctionaliseerd dekglaasje aan.
- Knip twee 20 cm lengte van polyethyleen buis en steek ze in de gaten in de kwarts dia.
- Seal de stroom cel met 5 minuten epoxy lijm.
- Als de lijm is uitgehard, prime de stroom cel en slang met buffer.
- Een ondersteunde lipide dubbellaag gevormd kan worden op dit moment door het opstellen ongeveer 80 microliter van het liposoom schorsing in de kanalen.
Virusdeeltje etikettering
- H3N2 influenza A (X-31) wordt doorgaans gebruikt voor de fusie-test, maar ook andere griep stammen en andere virussen zijn met succes gebruikt.
- Virus is gelabeld met maximaal twee verschillende fluorescente kleurstoffen om detectie van hemifusion en porie-vorming mogelijk te maken.
- Los sulforhodamine b (SRB) in HNE buffer tot een 20 mM oplossing. Combineer 20 microliter van de kleurstof oplossing met 10 microliter van de virale vering, en laat op kamertemperatuur gedurende 20 uur. Gedurende deze periode zal kleurstof langzaam ophopen in de virusdeeltjes.
- Verwijder de overtollige kleurstof door het passeren van de ophanging het virus door middel van een PD-10 ontzouten kolom. Als er genoeg viraal materiaal wordt gebruikt, kan een gekleurde band te zien in de kolom. Deze band bevat het label virus en kan worden verzameld zoals het is geëlueerd.
- Als er geen band zichtbaar is, het verzamelen van 200 microliter fracties en bepalen welke fracties bevatten, gelabeld virus door het meten van 565 nm absorptie op een spectrofotometer. Het virus moet elueren in een totaal volume van ongeveer 0,8 ml.
- Label de virale envelop door het toevoegen van 13 microliter van een 2 mM dimethyl formamide (DMF) oplossing van octadecyl rhodamine 110 (Rh110C18) om de SRB label virus schorsing.
- Roer de schorsing door het aanbrengen van de buis naar een laboratorium rotator en laat gedurende 3 uur.
- Zuiveren het virus uit overtollig Rh110C18 met behulp van een PD-10 ontzouten column zoals eerder beschreven.
Microscoop configuratie
Het experiment wordt uitgevoerd op een fluorescentiemicroscoop uitgerust met een hoge NA olie-immersie objectief geschikt voor totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie. De 488 en 568 nm lijnen van een argon / krypton gas laser worden gebruikt om de Rh110C18 en de SRB gelabeld virus te wekken. Gelijktijdige beeldvorming van elk etiket wordt bereikt door het splitsen van de groene en rode fluorescentie emissie met een dichroïde spiegel en onafhankelijk van elkaar het richten van de beelden op afzonderlijke helften van een elektron te vermenigvuldigen CCD camera.
Het uitvoeren van de test
Uitvoering van de fusie test omvat een stapsgewijze montage van de biochemische componenten in de stroom cel: de montage van de vlakke lipide dubbellaag, docking van gelabelde virusdeeltjes, het bekleden van het oppervlak met fluoresceïne, en initiatie van de reactie met een lage pH-buffer (figuur 1A) .
- Monteer de flow-cel op de microscoop podium, en bevestig de afvoer slang aan op een injectiepomp set te stromen met een snelheid van 40 microliter per minuut.
- Schakel de stroom-kanalen van overtollig liposomen door stroomt in 300 microliter van HNE.
- Focus van de microscoop en stel het laservermogen naar de oppervlakte te verlichten met 350 W / cm 2 van 488 nm licht en 70 W / cm 2 van 568 nm licht. Als u gebruik maakt van een 1,45 NA 60x olie-immersie objectief, stelt de laser intensiteiten 100 micro Watt en 20 Watt micro-, respectievelijk.
- Pomp gelabeld virus (verdund 1 / 100) in een flow-cel. Omdat het virus verspreidt naar de onderkant van de stroom kanaal, zal deeltjes beginnen te houden aan de ganglioside opgenomen in de lipide bilaag.
- Wanneer een geschikte dichtheid van gecoupeerd virusdeeltjes is bereikt (tot ongeveer 1000 deeltjes per gezichtsveld). Zet de inlaat slang aan op een oplossing met twee microgram per milliliter fluoresceïne gelabeld streptavidine. De gelabelde streptavidine zullen binden aan gekoppeld lipide moleculen biotine in de bilaag, en uiteindelijk een schemerige groene achtergrond zichtbaar.
- Was de stroom kanaal met 300 microliter van HNE.
- Kies een imaging gebied, de focus van de microscoop en de voorbereiding van de CCD-camera voor tijd verstreken beeldacquisitie. Stel de belichting tijd tot 100 ms en het verzamelen van beelden met een snelheid van 10 Hz.
- Initieer fusie door stroomt in een zure buffer die 10 mM natriumcitraat en 140 mM NaCl. De pH van de buffer moet worden aangepast aan lager zijn dan de kritische pH van het virus worden getest. X-31 zekeringen bij pH 5,5's hieronder.
Representatieve resultaten
Figuur 1B toont foto's van bilaag aangemeerd virionen voor en tijdens de fusie. Elke diffractie beperkt plek is een individuele virus deeltje. Rode en groene fluorescentie zijn afzonderlijk belicht worden op de boven-en onderkant helften van een CCD-camera, waardoor gelijktijdige observatie van de virale envelop en de inhoud labels. Er zijn meestal twee keer zo veel plekken in de groene kanaal ten opzichte vande rode, en dit weerspiegelt de lagere efficiëntie van de etikettering door de inhoud kleurstof in vergelijking met de envelop label. De groene achtergrond fluorescentie uitgezonden van het oppervlak gebonden fluoresceïne verdwijnt bij aankomst van de citraatbuffer en maakt de bepaling van de starttijd van de fusiereactie. Hemifusion gebeurtenissen worden gedetecteerd als uitbarstingen van groene fluorescentie als de gedoofd Rh110C18 in de virale envelop diffundeert door de hemifusion steel en is verdund in het vlakke membraan. Een naar buiten uit te breiden tl-cloud kan gezien worden rond hemifused deeltjes, waaruit blijkt gratis verspreiding van de vet-acyl verbonden kleurstof in het vlakke membraan. Poriën formatie wordt waargenomen als het verval van de rode fluorescentie van SRB gevangen in het interieur van de virale deeltjes. De opening van een fusie porie kan de kleurstof om te ontsnappen in de waterige ruimte onder de vlakke bilaag en uit de observatie regio.
Fluorescentie-intensiteit trajecten voor elk deeltje, dat wordt begrensd door de geïntegreerde intensiteit van individuele deeltjes, vergemakkelijken de bepaling van de opbrengst en tijden van hemifusion en poriën vorming (Fig. 1C). Hemifusion en porie vorming event tijden worden bepaald als het punt waarop de maximale helling van een Rh110C18 fluorescentie burst of SRB signaal verval optreedt. In een geslaagd experiment, ongeveer 50 procent van de deeltjes gelabeld met Rh110C18 opbrengst dequenching signalen, en 30 procent van de SRB gelabelde deeltjes geven bruikbaar signaal. Van de deeltjes gelabeld met beide kleurstoffen, ongeveer 10 procent zien zowel lipide mengen en poriën vorming van signalen.
Fig. 2A-C toont de verdeling van hemifusion en poriën formatie lag tijden van een typisch experiment. Fig.2D-F toont evenement verdelingen van gebeurtenissen combinatie van vijf experimenten uitgevoerd onder dezelfde omstandigheden. Zelfs met een bescheiden aantal waarnemingen, de vorm van de histogrammen is duidelijk. Omdat elk experiment wordt gesynchroniseerd door detectie van de pH-daling de tijd, kunnen meerdere experimenten worden gecombineerd en gedetailleerde informatie over de snelheidsbepalende tussenliggende stappen kunnen worden verkregen.
Figuur 1. Experimental design. A) Virus deeltjes zijn gelabeld met twee fluorescente kleurstoffen op de kinetiek van hemifusion en fusie poriën vorming van monitoren. Fluorescentie wordt verzameld door een hoge-NA microscoop doelstelling en afgebeeld op een CCD. B) Fluorescentie afbeeldingen voor (links) en tijdens de (rechts) de fusie van de individuele virale deeltjes. Boven-en onderste helft van elke afbeelding komen overeen met de rode en groene fluorescentie, respectievelijk, van hetzelfde ~ 50 x 100 mm 2-gebied van de ondersteunde bilaag. C) De fluorescentie-intensiteit van de rode SRB virale content tracer (bovenste spoor), de groene kleurstof Rh110C18 membraan (midden sporen), en de fluoresceïne pH-sensor (onderste spoor) geven de exacte tijden is verstreken tussen pH-daling, hemifusion, en fusie. Gelieve Klik hier voor een grotere versie van figuur 1 te zien.
Figuur 2. Fusion kinetiek van fluorescent gemerkte virus. Verdelingen van de tijd is verstreken tussen de pH-daling en hemifusion (A, D) en de poriën vorming (B, E). De opkomst en het verval van de distributies wijzen op de aanwezigheid van meerdere tussenliggende stappen. De overgang tussen hemifusion en de opening van een fusie-porie voor individuele deeltjes is exponentieel verdeeld, hetgeen duidt op een enkele snelheidsbeperkende stap. AC panelen tonen de resultaten van een experiment. DF-panelen zijn samengesteld uit vijf verschillende experimenten uitgevoerd onder dezelfde omstandigheden. Gelieve Klik hier voor een grotere versie van figuur 2 te zien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De voorbereiding van vocht en continue ondersteund lipidendubbellagen kan een uitdaging zijn. Sporen van verontreinigende materiaal of oppervlak fouten zal voorkomen dat de verspreiding van dubbellagen. Zorgvuldige reiniging en afzetting van een uniforme laag van dextran zijn essentieel.
Langdurig beeldvorming van virusdeeltjes kan het bleken van de fluorescente labels of ervoor zorgen dat ze worden geïnactiveerd. Foto-schade van deze soort is bekend in de bio-imaging en single molecule velden en wordt algemeen aangenomen dat het gevolg zijn van de generatie van reactieve zuurstof species door de opgewonden fluoroforen. Het minimaliseren van foto-schade, we over het algemeen het minimaliseren van de excitatie laservermogen en vermijd langdurige blootstelling vóór het begin van het experiment. Uitputting van zuurstof uit de buffers met een van de vele zuurstof gemelde afvoersystemen kan nuttig zijn.
De mogelijkheid om informatie over de voorbijgaande tussenliggende staten te krijgen vereist dat de fusie reactie nauwkeurig worden gesynchroniseerd. De gebruikte debiet en het dode volume van de inlaat slang en flow cel kanaal zijn factoren die kunnen beperken synchronisatie. Fusion is een initiatief van het uitwisselen van neutraal voor zure pH-buffer. Echter, als de zure buffer reist door de inlaat slang in de stroom cel, de interface tussen de twee buffers mixen door middel van diffusie en wordt het steeds minder goed gedefinieerd. De resulterende pH gradiënt te hebben op de bilaag oppervlak de neiging te vervagen de bepaling van de starttijd. Aangezien fusie kinetiek is afhankelijk van de proton concentratie, zou een pH gradiënt bij het begin van het experiment bemoeilijken de interpretatie van de resultaten. In het experiment laten zien hier, de kinetiek van kernfusie is veel trager dan de pH overgangstijd, en de gradiënt effect heeft geen significante invloed fusie kinetiek. We zijn momenteel bezig met aanpassingen aan onze flow cellen die in staat zou stellen ons in de inlaat slang te primen met de gewenste buffer voor het omleiden van de stroom in de stroom cel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Het werk werd ondersteund door NIH subsidie AI57159 (tot SCH) en AI72346 (tot AMvO). SCH is een Howard Hughes Medical Institute Investigator.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corning cover glass squares, 25 mm | Sigma-Aldrich | CLS286525 | |
| Fused silica slides | Technical Glass | ||
| Staining rack | Thomas Scientific | 8542E40 | |
| (3- glycidoxypropyl)trimethoxysilane | Gelest Inc. | SIG5840.1 | |
| Dextran T-500 | Pharmacosmos | 5510 0500 4006 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipid, Inc | 850375 | |
| 1-palmitoyl-2oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti Polar Lipid, Inc | 850457 | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipid, Inc | 700000 | |
| N-((6-(biotinoyl)amino)hexanoyl)-1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosph–thanolamine, triethylammonium salt (biotin-X DHPE) | Invitrogen | B1616 | |
| Streptavidin, fluorescein conjugate | Invitrogen | S-869 | |
| Disialoganglioside GD1a from bovine brain | Sigma-Aldrich | G2392 | |
| Mini Extruder | Avanti Polar Lipid, Inc | 610000 | |
| 0.1 micron polycarbonate membrane filters | Whatman, GE Healthcare | 800309 | |
| 10 mm drain discs (membrane supports) | Whatman, GE Healthcare | 230300 | |
| Sulforhodamine b sodium salt | S1402 | ||
| Octadecyl rhodamine 110 (Rh110C18) | See Floyd et al. 2008 for synthesis protocol | ||
| PD-10 desalting columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| Nikon fluorescence microscope | Nikon Instruments | TE2000-U | |
| Plan Apo TIRF 60x 1.45 NA objective | Nikon Instruments | ||
| Innova 70C Spectrum Ar/Kr laser | Coherent Inc. | ||
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | 702213 |
References
- Elender, G., Kuhner, M., Sackmann, E. Functionalisation of Si/SiO2 and glass surfaces with ultrathin dextran films and deposition of lipid bilayers. Biosens Bioelectron. 11, 565-577 (1996).
- Floyd, D. L., Ragains, J. R., Skehel, J. J., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. Single-particle kinetics of influenza virus membrane fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15382-15387 (2008).
