Summary
Wir präsentieren einen
Abstract
Membranfusion ist ein wesentlicher Schritt bei der Eingabe von umhüllten Viren in die Zellen. Konventionelle Fusion-Assays in der Regel über eine große Anzahl von Fusion Events, so dass es schwierig quantitativ zu analysieren die Reihenfolge der molekularen Schritte. Wir haben eine in vitro entwickelt, zwei-Farben-Fluoreszenz-Assay zur Kinetik der einzelnen Viruspartikel Verschmelzung mit einer Ziel-Doppelschicht auf einer im Wesentlichen Flüssigkeit Unterstützung zu überwachen.
Influenza Virus-Partikel sind mit einem grünen lipophilen Fluorophor an die Membran und eine rote hydrophilen Fluorophor an die virale Innenraum Fleck Fleck inkubiert. Wir deponieren ein Gangliosid-haltigen Lipid-Doppelschicht auf der Dextran-funktionalisierten Glasoberfläche einer Durchflusszelle, bebrüten die Viruspartikel auf der planaren Bilayer und Bild der Fluoreszenz einer 100 x 100 pm 2-Gebiet, mit mehreren hundert Partikel, auf einem CCD Kamera. Durch die Abbildung die rote und grüne Fluoreszenz können wir gleichzeitig überwachen das Verhalten der Membran-Farbstoff (grün) und der wässrigen Inhalt (rot) der Partikel.
Beim Absenken des pH auf einen Wert unterhalb der Fusion pH-Wert, werden die Partikel mit der Membran verschmelzen. Hemifusion, die Verschmelzung der äußeren Blatt der viralen Membran mit dem äußeren Blatt der Zielmembran, wird sichtbar, wie eine plötzliche Veränderung in der grünen Fluoreszenz eines Teilchens. Bei der anschließenden Fusion der beiden verbleibenden distalen Flugblättern eine Pore wird gebildet werden und die rot-emittierenden Fluorophors in der Viruspartikel wird unter dem Zielmembran freigegeben werden. Diese Veranstaltung wird zu einer Abnahme der roten Fluoreszenz der einzelnen Teilchen. Schließlich berichtet der integrierten Fluoreszenz aus einer pH-sensitiven Fluorophor, dass in der Ziel-Membran eingebettet ist auf den genauen Zeitpunkt der pH-Abfall.
Von den drei Fluoreszenz-time Spuren lassen sich alle wichtigen Ereignisse (pH-Abfall-, Lipid-Mischung auf hemifusion, Content-Mischen nach Porenbildung) jetzt auf einfache Weise und für jedes Teilchen einzeln entnommen werden. Durch das Sammeln der verstrichenen Zeit für die verschiedenen Übergänge für viele einzelne Partikel in Histogramme, können wir die Lebensdauer der entsprechenden Zwischenprodukte. Auch versteckte Zwischenprodukte, die nicht über eine direkte Fluoreszenz beobachtbar können direkt visualisiert werden aus diesen Histogrammen.
Protocol
Deckglas Funktionalisierung
Die planare Doppelschicht in der Fusion-Assay verwendet wird, auf eine hydratisierte Film von Dextran unterstützt. Dextran dient als Abstandshalter zwischen den planaren Bilayer und Glasoberfläche. Dies verhindert Membran-Komponenten erst gar nicht auf der Glasoberfläche fest und bietet auch Raum in dem die Inhalte einer Virus-Partikel können auf Fusion zu entkommen. Deckgläser werden durch Behandlung mit einem Epoxysilan, die uns chemisch binden Dextran, das Glas (Elender, et al. 1996) ermöglicht funktionalisiert.
- Vereinbaren Sie 25 mm Deckgläschen in einer keramischen Färbebank und Platz im Rack in ein Glas oder Becher.
- Füllen Sie den Behälter mit einer 10% igen Laborqualität Glaswaren Reinigungsmittel. Stellen Sie den Behälter in einem Ultraschall-Reinigungsgerät für 30 Minuten.
- Spülen Sie den Behälter und Deckglas Rack mit deionisiertem Wasser und füllen Sie mit 1M postassium Hydroxid. Bringen Sie den Behälter zum Ultraschallbad für weitere 30 Minuten.
- Wiederholen Sie diesen Reinigungsvorgang unter Verwendung von Aceton und Ethanol.
- Spülen Sie den coverlips in Wasser und trocknen.
- Schließlich, reinigen Sie die Deckgläser mit einem Sauerstoff-Plasma-Stripper für drei Minuten.
- Der letzte Reinigungsschritt oxidiert die Oberfläche, so dass das Glas gleichmäßig hydrophil und reaktiven in den folgenden Silanisierung Schritte.
- Bereiten Sie eine 0,2% ige Lösung von 3-Glycidoxypropyltrimethoxysilan in Isopropanol. Tauchen Sie die Deckgläser in dieser Lösung für 5 Minuten.
- Entsorgen Sie die Silan-Lösung und spülen Sie die Deckgläser mehrmals in Isopropanol.
- Die Deckgläser werden nun mit einer Schicht aus Silan beschichtet, aber sie müssen gehärtet werden, um damit das Silan kovalent an das Glas. Legen Sie die Deckgläser in einem Ofen auf 80 Grad Celsius für eine Stunde.
- Während die Deckgläser Aushärtung sind, wiegen Sie Dextran 500 und erstellt einen 30% w / v Lösung. Vorwärmen des Wassers wird die Beihilfe Auflösung. Wir werden ca. 1 ml dieser Lösung pro Deckglas. Sobald die Dextran gelöst hat, entschäumen die Lösung in einem Vakuumexsikkator.
- Wenn die silanisierte Deckgläschen abgeschlossen haben Härtung, entfernen Sie sie aus der Keramik-Rack und ordnen Sie sie flach auf der Innenseite einer Kunststoff-Gefrierfach. Verwenden einer 1 ml Pipette auf die Oberseite eines jeden Deckglas mit ca. 1 ml der Dextranlösung decken. Schließen Sie das Gefrierfach und lassen Sie sich in einem ruhigen Platz für 24-36 Stunden.
- Fassen Sie die Deckgläser mit Kunststoff-Pinzette, giesst die überschüssige Dextran und ersetzen Sie sie in die Keramik-Rack. Spülen Sie die Deckgläser mehrmals in Wasser, und lassen Sie die Deckgläschen in Wasser für 48 Stunden einweichen. Das Glas kann leicht auf einem Tisch-Rotator geschüttelt werden.
- Trocknen Sie die Deckgläser in einem Ofen auf 80 Grad Celsius und speichern in einem Vakuum-Exsikkator.
Liposomenzubereitung
Lipiddoppelschichten sind durch Adsorption Liposomen zu einer Dextran funktionalisierten Deckglas gebildet. Die adsorbierten Liposomen verschmelzen mit einander, bis Membran reißt und breitet sich flach über der Oberfläche.
- Ein typisches Liposomenformulierung im Assay verwendet wird, besteht aus 1,2, Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DOPC), 1-Oleoyl-2-Palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (POPC), Cholesterin, Rinderhirn Disialoganglioside (GD 1a) und N-((6 - (Biotinoyl) amino) Hexanoyl) -1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-Phosphoethanolamin in einem Verhältnis von 4:4:2:0.1:5 x10 -5. Alle Komponenten sind in Chloroform oder Chloroform und Methanol-Lösungen gespeichert.
- Bereiten Sie eine Mischung aus zwei Mikromol Lipid durch die Übertragung von Mengen der einzelnen Komponenten in ein Reagenzglas. Das Lösungsmittel wird unter einem Strom von Argon oder Stickstoff. Entfernen Sie das restliche Lösungsmittel, indem man das Reagenzglas in einen Vakuumexsikkator für zwei Stunden.
- Resuspendieren getrocknete Lipidfilm in 400 Mikroliter HNE-Puffer (5 mM HEPES, 145 mM NaCl, 0,1 mM EDTA).
- Übertragen Sie die Suspension auf eine Kunststoff-Mikrozentrifugenröhrchen. Einfrieren der Suspension in einem Bad aus flüssigem Stickstoff und Auftauen in einem warmen Wasserbad. Wiederholen Sie diesen Frost / Tau-Zyklus viermal.
- Montieren einer Lipid-Extruder mit einer 100 nm Polycarbonat-Membranfilter, und extrudieren die Lipidsuspension 25-mal. Die Suspension sollte erscheinen zu mehr Transparenz nach der Extrusion.
- Liposomen sollten am Tag sind sie bereit verwendet werden. Sie können bei Raumtemperatur gelagert werden, bis verwendet.
Mikrofluidik-Messzelle Vorbereitung
Eine einfache mikrofluidischen Durchflusszelle ist durch Einfügen doppelte Klebeband zwischen einem Quarz-Rutsche und einer funktionalisierten Deckglas gemacht.
- Besorgen Sie sich ein 20x20x3 mm Quarz-Objektträger. Verwenden Sie einen Diamantkugel zwei 1 mm Löcher an gegenüberliegenden Seiten bohren.
- Schneiden Sie ein 20 mm ² aus einem Blatt der doppelten Klebeband, und mit einer Rasierklinge, schneiden Sie ein 15 x 2 mm Ausschnitt aus dem Zentrum.
- Ziehen Sie eine Seite des Bandes sichern, und halten das Band an der quartz gleiten. Beachten der anderen Seite zu einer funktionalisierten Deckglas.
- Schneiden Sie zwei 20 cm Länge aus Polyethylen-Schlauch und stecken sie in die Löcher in der Quarz-Objektträger.
- Seal die Flusszelle mit 5 Minuten Epoxy-Kleber.
- Wenn der Kleber ausgehärtet ist, prime die Durchflusszelle und Schläuche mit Puffer.
- Ein unterstützter Lipiddoppelschicht kann in diesem Stadium, indem etwa 80 Mikroliter der Liposomen-Suspension in die Kanäle gebildet werden.
Viruspartikel Kennzeichnung
- H3N2 Influenza A (X-31) ist in der Regel für die Fusion-Assay verwendet, aber auch andere Grippestämme und anderen Viren wurden erfolgreich eingesetzt.
- Virus ist mit bis zu zwei unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert den Nachweis von hemifusion und Poren-Bildung zu ermöglichen.
- Lösen Sie Sulforhodamin b (SRB) in HNE-Puffer zu einer 20 mM Lösung zu machen. Kombinieren Sie 20 Mikroliter der Lösung des Farbstoffes mit 10 Mikroliter der Virussuspension, und lassen bei Raumtemperatur für 20 Stunden. Während dieser Zeit wird Farbstoff langsam in die Viruspartikel akkumulieren.
- Entfernen Sie die überschüssige Farbe, indem der die Virussuspension durch eine PD-10 Entsalzungssäule. Wenn genug viralem Material verwendet wird, kann ein farbiges Band in der Spalte zu sehen. Dieser Band enthält beschriftet Virus und kann gesammelt, wie es ist, eluiert werden.
- Wenn kein Band zu sehen ist, sammeln 200 Mikroliter Fraktionen und bestimmen, welche Fraktionen enthalten beschriftet Virus durch die Messung 565 nm Absorption auf einem Spektralphotometer. Das Virus sollte in einem Gesamtvolumen von ca. 0,8 ml eluieren.
- Beschriften Sie die Virushülle von Zugabe von 13 Mikroliter einer 2 mM Dimethylformamid (DMF)-Lösung von Octadecyl Rhodamin 110 (Rh110C18), um den SRB gekennzeichnet Virussuspension.
- Rühre die Suspension durch das Anbringen der Röhre in ein Labor-Rotator und lassen für 3 Stunden.
- Purify das Virus von überschüssigem Rh110C18 mit einer PD-10 Entsalzungssäule wie zuvor beschrieben.
Mikroskop-Konfiguration
Das Experiment basiert auf einem Fluoreszenz-Mikroskop mit einer hohen NA Ölimmersionsobjektiv geeignet für Total Internal Reflection Fluorescence Mikroskopie ausgestattet war. Die 488 und 568 nm Linien aus einem Argon / Krypton-Gas-Laser verwendet, um die Rh110C18 und SRB gekennzeichnet Virus zu erregen. Gleichzeitige Darstellung von jedem Etikett ist durch die Spaltung der grünen und roten Fluoreszenz-Emission mit einem dichroitischen Spiegel erreicht und unabhängig konzentriert die Bilder auf getrennten Hälften eines Elektrons multipliziert CCD-Kamera.
Durchführung des Tests
Die Ausführung der Fusion Test beinhaltet eine stufenweise Zusammenbau des biochemischen Komponenten innerhalb der Messzelle: Montage der planaren Lipid-Doppelschicht, Docking-markierter Viruspartikel, die Beschichtung der Oberfläche mit Fluorescein und dem Anspringen der Reaktion bei niedrigen pH-Puffer (Abbildung 1A) .
- Montieren Sie die Flow-Zelle auf dem Mikroskoptisch, und befestigen Sie den Ablaufschlauch auf eine Spritzenpumpe, die bei einem Steuersatz von 40 Mikroliter pro Minute fließen.
- Deaktivieren Sie die Strömungskanäle von überschüssigem Liposomen durch fließendes in 300 Mikroliter HNE.
- Fokus des Mikroskops und stellen Sie die Laserleistung, die Oberfläche mit 350 W / cm 2 von 488 nm-Licht und 70 W / cm 2 von 568 nm Licht zu beleuchten. Wenn Sie mit einem 1,45 NA 60x Ölimmersionsobjektiv sind, stellen Sie den Laser-Intensitäten zu 100 Mikro-Watt und 20 Watt Mikro-bzw..
- Pump gekennzeichnet Virus (verdünnt 1 / 100) in eine Durchflusszelle. Da das Virus diffundiert an der Bodenfläche des Strömungskanals wird Partikel beginnen zu dem Gangliosid in die Lipid-Doppelschicht eingebaut bleiben.
- Wenn ein geeigneter Dichte angedockt Viruspartikel erreicht wurde (bis etwa 1000 Teilchen pro field of view). Schalten Sie den Zulaufschlauch, um eine Lösung mit zwei Mikrogramm pro Milliliter Fluorescein markiertem Streptavidin. Die markierten Streptavidin binden gekoppelt Lipid-Moleküle in der Doppelschicht Biotin, und schließlich ein schwaches grünen Hintergrund sichtbar sein wird.
- Waschen Sie den Strömungskanal mit 300 Mikroliter HNE.
- Wählen Sie eine Imaging-Bereich, konzentrieren die Lupe und bereiten die CCD-Kamera für zeitversetzt Bildaufnahme. Stellen Sie die Belichtungszeit auf 100 ms und sammeln Bilder bei einer Rate von 10 Hz.
- Initiieren Fusion durch fließendes in einem sauren Puffer mit 10 mM Natriumcitrat und 140 mM NaCl. Der pH-Wert des Puffers sollte so eingestellt werden unterhalb des kritischen pH-Wert des Virus untersucht werden. X-31 Sicherungen bei pH-Werten unter 5,5.
Repräsentative Ergebnisse
Abbildung 1B zeigt Schnappschüsse von Doppelschicht angedockt Virionen vor und während der Fusion. Jeder beugungsbegrenzten Spot stellt eine einzelne Viruspartikel. Rote und grüne Fluoreszenz wurden getrennt auf den oberen und unteren Hälften einer CCD-Kamera abgebildet, so dass die gleichzeitige Beobachtung der Virushülle und Content-Etiketten. Es gibt in der Regel doppelt so viele Punkte in den grünen Kanal im Vergleich zudie rote, und dies spiegelt die geringere Effizienz der Kennzeichnung durch den Inhalt Farbstoff im Vergleich zu den Umschlag-Label. Der grüne Hintergrund-Fluoreszenz von der Oberfläche emittierte gebunden Fluorescein verschwindet bei der Ankunft der Citrat-Puffer und erlaubt die Bestimmung der Startzeit der Fusionsreaktion. Hemifusion Ereignisse werden als platzt der grünen Fluoreszenz als abgeschreckt Rh110C18 in der Virushülle diffundiert durch die hemifusion Stiel erkannt und ist in der planaren Membran verdünnt. Ein nach außen erweitert fluoreszierende Wolke kann um hemifused Teilchen betrachtet werden, zeigt freie Diffusion der Fettsäuren-Acyl verbunden Farbstoff in die planare Membran. Porenbildung ist als der Zerfall von roten Fluoreszenz von SRB in das Innere der viralen Partikel gefangen beobachtet. Die Eröffnung eines Fusionspore ermöglicht der Farbstoff in die wässrige Raum unterhalb der planaren Bilayer und aus der Beobachtung Region zu entkommen.
Fluoreszenzintensität Trajektorien für jedes Teilchen, aufgetragen von der integrierten Intensitäten der einzelnen Teilchen, erleichtern die Bestimmung der Ausbeute und Zeiten der hemifusion und Porenbildung (Abb. 1C). Hemifusion und Porenbildung bei Zeiten sind als der Punkt, an dem die maximale Steigung einer Rh110C18 Fluoreszenz platzen oder SRB Signalabfall tritt bestimmt. In einem erfolgreichen Experiment, geben etwa 50 Prozent der Partikel mit Rh110C18 Ertrag Dequenching Signale, und 30 Prozent der SRB markierten Partikel bezeichnet nutzbare Signal. Der Teilchen mit den beiden Farbstoffen markiert, zeigen rund 10 Prozent sowohl Lipid Misch-und Porenbildung Signale.
Abb.. 2A-C zeigt die Verteilung der hemifusion und Porenbildung Verzögerungszeiten von einem typischen Experiment. Fig.2D-F zeigt Event-Verteilungen von Ereignissen aus fünf Experimenten unter den gleichen Bedingungen durchgeführt kombiniert. Auch bei einer bescheidenen Anzahl der Beobachtungen ist die Form der Histogramme deutlich. Da jedes Experiment durch den Nachweis des pH-Abfall-Zeit synchronisiert wird, können mehrere Experimente miteinander kombiniert werden und detaillierte Informationen über Rate-Limiting Zwischenschritte erreicht werden kann.
Abbildung 1. Experimental Design. A) Virus Partikel sind mit zwei Fluoreszenzfarbstoffen markiert, um die Kinetik der hemifusion und Fusion Porenbildung zu überwachen. Die Fluoreszenz wird durch einen High-NA Mikroskopobjektiv gesammelt und abgebildet auf eine CCD. B) Fluoreszenz Bilder vor (links) und während (rechts) die Verschmelzung der einzelnen Viruspartikel. Obere und untere Hälfte jedes Bild, um die rote und grüne Fluoreszenz entsprechen jeweils der gleichen ~ 50 x 100 mm 2 Fläche der unterstützten Doppelschicht. C) Die Intensität der Fluoreszenz der roten SRB virale Inhalte Tracer (obere Kurve), bieten die grünen Rh110C18 Membran-Farbstoff (Mitte Spur), und die Fluorescein-pH-Sensor (untere Kurve) die genauen Zeiten zwischen pH-Abfall, hemifusion und Fusion vergangen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version der Abbildung 1 zu sehen.
Abbildung 2. Fusion Kinetik der fluoreszenzmarkierten Virus. Verteilungen der Zeit zwischen dem pH-Abfall und hemifusion (A, D) und Porenbildung (B, E) verstrichen sind. Der Aufstieg und Verfall der Verteilungen weisen auf das Vorhandensein von mehreren Zwischenschritten. Der Übergang zwischen hemifusion und Eröffnung einer Fusionspore für einzelne Partikel ist exponentiell verteilt, was auf einen einzigen geschwindigkeitsbestimmenden Schritt. Panels AC zeigen die Ergebnisse einer einzigen Experiment. Panels DF sind aus fünf verschiedenen Experimenten unter den gleichen Bedingungen durchgeführt zusammengestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version der Abbildung 2 zu sehen.
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Discussion
Vorbereitung von Flüssigkeit und kontinuierliche Lipiddoppelschichten kann schwierig sein. Spuren von Verunreinigung materieller oder Oberflächenfehler verhindert Ausbreitung von Doppelschichten. Eine sorgfältige Reinigung und Abscheidung einer gleichmäßigen Schicht von Dextran sind unerlässlich.
Längerer Abbildung von Viruspartikeln können Bleichmittel der fluoreszierenden Markierungen oder diese wieder inaktiviert. Photo-Schäden dieser Art ist auch in der Bio-Imaging und Einzelmolekül-Bereichen bekannt und wird allgemein angenommen, dass bei der Erzeugung von reaktiven Sauerstoff-Spezies von den angeregten Fluorophoren Stammzellen. Zur Minimierung der Foto-Schäden, wir generell zu minimieren die Anregung Laserleistung und vermeiden längerer Exposition vor Beginn des Experiments. Depletion von Sauerstoff aus dem Puffer mit einem der mehreren Sauerstoffbindung Systemen gemeldet als nützlich erweisen könnte.
Die Fähigkeit, Informationen über transiente Zwischenzustände zu bekommen verlangt, dass die Fusionsreaktion genau aufeinander abgestimmt sein. Die Durchflussmenge eingesetzt und das Totvolumen der Zulaufschlauch und Durchflusszelle Kanal sind Faktoren, die Synchronisation zu begrenzen. Fusion wird durch den Austausch neutral für saure pH-Puffer eingeleitet. Da jedoch die sauren Puffer wandert durch den Zulaufschlauch in die Messzelle, mischt die Schnittstelle zwischen den beiden Puffern durch Diffusion und wird zunehmend weniger gut definiert. Die resultierende pH-Gradienten in der Doppelschicht Oberfläche neigt dazu, die Bestimmung der Startzeit zu verwischen. Da außerdem Fusion Kinetik ist abhängig von Protonenkonzentration, könnte einen pH-Gradienten zu Beginn des Experiments erschweren die Interpretation der Ergebnisse. Im Experiment zeigte sich hier, ist die Kinetik der Fusion viel langsamer als die pH Übergangszeit, und der Gradient-Effekt nicht signifikant beeinflusst Fusion Kinetik. Wir arbeiten derzeit an Änderungen an unseren Flow-Zellen, die es uns ermöglichen, den Zulaufschlauch mit dem gewünschten Puffer prime vor dem Umleiten der Strömung in die Durchflusszelle würde.
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Acknowledgments
Die Arbeit wurde durch die NIH gewährt AI57159 (SCH) und AI72346 (bis AMvO) unterstützt. SCH ist ein Howard Hughes Medical Institute Investigator.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corning cover glass squares, 25 mm | Sigma-Aldrich | CLS286525 | |
| Fused silica slides | Technical Glass | ||
| Staining rack | Thomas Scientific | 8542E40 | |
| (3- glycidoxypropyl)trimethoxysilane | Gelest Inc. | SIG5840.1 | |
| Dextran T-500 | Pharmacosmos | 5510 0500 4006 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipid, Inc | 850375 | |
| 1-palmitoyl-2oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti Polar Lipid, Inc | 850457 | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipid, Inc | 700000 | |
| N-((6-(biotinoyl)amino)hexanoyl)-1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosph–thanolamine, triethylammonium salt (biotin-X DHPE) | Invitrogen | B1616 | |
| Streptavidin, fluorescein conjugate | Invitrogen | S-869 | |
| Disialoganglioside GD1a from bovine brain | Sigma-Aldrich | G2392 | |
| Mini Extruder | Avanti Polar Lipid, Inc | 610000 | |
| 0.1 micron polycarbonate membrane filters | Whatman, GE Healthcare | 800309 | |
| 10 mm drain discs (membrane supports) | Whatman, GE Healthcare | 230300 | |
| Sulforhodamine b sodium salt | S1402 | ||
| Octadecyl rhodamine 110 (Rh110C18) | See Floyd et al. 2008 for synthesis protocol | ||
| PD-10 desalting columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| Nikon fluorescence microscope | Nikon Instruments | TE2000-U | |
| Plan Apo TIRF 60x 1.45 NA objective | Nikon Instruments | ||
| Innova 70C Spectrum Ar/Kr laser | Coherent Inc. | ||
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | 702213 |
References
- Elender, G., Kuhner, M., Sackmann, E. Functionalisation of Si/SiO2 and glass surfaces with ultrathin dextran films and deposition of lipid bilayers. Biosens Bioelectron. 11, 565-577 (1996).
- Floyd, D. L., Ragains, J. R., Skehel, J. J., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. Single-particle kinetics of influenza virus membrane fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15382-15387 (2008).
