Metod för mätning av Viral Fusion Kinetics på enskild partikel nivå

Summary

Vi presenterar ett

Abstract

Membran fusion är ett viktigt steg vid införandet av höljeförsedda virus in i cellerna. Konventionella fusion analyser rapport vanligtvis på ett stort antal av fusion händelser, gör det svårt att kvantitativt analysera sekvensen av de inblandade molekylära steg. Vi har utvecklat en in vitro, tvåfärgad fluorescens-analysen för att övervaka kinetik av enstaka viruspartiklar fixering med ett mål tvåskiktsmembran på huvudsakligen vätska stöd.

Influensa viruspartiklar inkuberas med en grön lipofil fluoroforen att färga membranet och en röd hydrofil fluoroforen att färga den virala interiör. Vi deponera en ganglioside innehåller membranet på dextran-functionilized glasytan ett flöde cell, Inkubera viruspartiklar på plana tvåskiktsmembran och bild fluorescens av en 100 x 100 ìm ^2-området, som innehåller flera hundra partiklar på en CCD kameran. Genom imaging både röda och gröna fluorescens, kan vi övervaka samtidigt beteende membranet färg (grön) och vattenfasen innehåll (röd) av partiklarna.

Vid sänkning av pH till ett värde som underskrider den fusion pH, kommer partiklarna säkring med membranet. Hemifusion, en sammanslagning av den yttre bipacksedel virala membran med den yttre bipacksedel målet membranet, kommer att synas som en plötslig förändring i grön fluorescens av en partikel. Vid den efterföljande fusion av de två återstående distala flygblad en por kommer att bildas och den röda som avger fluoroforen i det virala partiklar kommer att släppas under målet membranet. Denna händelse kommer att leda till en minskning av röda fluorescens av enskilda partiklar. Slutligen, rapporterar den integrerade fluorescens från ett pH-känsligt fluoroforen som är inbäddat i målet membranet på den exakta tiden för pH-värdet sjunker.

Från de tre fluorescens-time spår, kan alla viktiga händelser (pH-värdet sjunker, lipid blandning på hemifusion, innehåll blandning på porbildning) nu hämtas på ett enkelt sätt och för varje partikel individuellt. Genom att samla förfluten tid för de olika övergångar för många enskilda partiklar i histogram, kan vi bestämma livslängd för motsvarande intermediärer. Även dolda intermediärer som inte har en direkt fluorescerande observerbart kan visualiseras direkt från dessa histogram.

Protocol

Skyddsglas slip funktionalisering

Den plana tvåskiktsmembran används i fusion-analysen ligger på ett hydrerad film av dextran. Dextran fungerar som en distans mellan den plana tvåskiktsmembran och glasytan. Detta förhindrar membran komponenter från fastna på glasytan och ger också utrymme till vilka innehållet i ett virus partikel kan fly vid fusion. Glas täckglas är functionalized genom behandling med en epoxi silan, vilket ger oss möjlighet att kemiskt band dextran mot glaset (Elender, et al. 1996).

1. Ordna 25 mm täckglas i ett keramiskt färgning rack, och placera stället i en burk eller bägare.
2. Fyll behållaren med en 10% lösning av laboratoriekvalitet glas tvättmedel. Placera behållaren i ett ultraljud renare i 30 minuter.
3. Skölj behållaren och täckglas rack med avjoniserat vatten och fyll på med 1M postassium hydroxid. Återgå behållaren till badet sonicator i ytterligare 30 minuter.
4. Upprepa denna rengöring med aceton och etanol.
5. Skölj coverlips i vatten och torka.
6. Slutligen rengöra täckglas med ett syre plasma strippa i tre minuter.
7. Det sista rengöring steget oxiderar på ytan, vilket gör glaset jämnt hydrofila och reaktiva i följande silaniseringen steg.
8. Bered en 0,2% lösning av 3-glycidoxypropyltrimethoxy silan i isopropanol. Doppa täckglas i lösningen under fem minuter.
9. Kasta silan lösningen och skölj täckglasen flera gånger i isopropanol.
10. Den täckglas är nu täckta med ett lager av silan, men de måste botas så att silan att kovalent binder till glaset. Placera täckglas i en ugn inställd på 80 grader i en timme.
11. Medan täckglas är att bota, väg upp dextran 500 och förbereda en 30% w / v lösning. Förvärmning vattnet kommer att underlätta upplösningen. Vi kommer att använda ca 1 ml av lösningen per täckglas. När dextran har lösts upp defoam lösningen i vakuumexsickator.
12. När silaniseras täckglas är klar bota, ta bort dem från de keramiska rack och ordna dem platt på insidan av en plast frys box. Använd en 1 ml pipett för att täcka upp ytan på varje täckglas med ~ 1 ml av dextran lösningen. Stäng frysfack och lämna på en lugn plats för 24-36 timmar.
13. Medan greppa täckglas med plast pincett, häll bort överflödig dextran och ersätta dem i den keramiska racket. Skölj täckglasen flera gånger i vatten och låta täckglas i blöt i vatten i 48 timmar. Burken kan vara försiktigt upprörd på en bordsskiva rotator.
14. Torka täckglas i en ugn inställd på 80 grader Celsius och förvara i en vakuumexsickator.

Liposomer Förberedelser

Stöds lipid bilayers bildas genom att adsorbera liposomlösningen till en dextran functionalized täckglas. Den adsorberade liposomer säkring med varandra tills membran spricker och sprider sig platt över ytan.

1. En typisk liposomberedning används i analysen består av 1,2, dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC), (POPC) 1-oleoyl-2-Palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, kolesterol, bovin hjärna Disialoganglioside (GD _1a), och N-((6 - (biotinoyl) amino) Hexanoyl) -1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine i förhållandet 4:4:2:0.1:5 x10 ^-5. Alla komponenter finns lagrade i kloroform eller kloroform och lösningar metanol.
2. Förbered en blandning som innehåller två mikromol lipid genom att överföra volymer av varje komponent i ett provrör. Avdunsta lösningsmedel i en ström av argon eller kvävgas. Avlägsna återstående lösningsmedel genom att lämna provröret i en vakuumexsickator i två timmar.
3. Resuspendera torkade lipid filma i 400 mikroliter av HNE buffert (5 mm HEPES, 145 mM NaCl, 0,1 mM EDTA).
4. Överför suspensionen till en plast mikrocentrifugrör. Frys suspensionen i en flytande kväve bad och tina i ett varmt vattenbad. Upprepa detta frys / tö cykel fyra gånger.
5. Montera en lipid extruder med en 100 nm polykarbonatmembranfilter och pressa den lipid fjädring 25 gånger. Suspensionen skulle tyckas vara mer öppen efter extrudering.
6. Liposomer bör användas samma dag de är beredda. De kan förvaras i rumstemperatur tills det används.

Mikroflödessystem flöde cellberedningen

En enkel mikroflödessystem flödescell görs av sandwiching dubbel tejp mellan en kvarts bild och en functionalized täckglas.

1. Skaffa en 20x20x3 mm kvarts bild. Använd en diamant Burr att borra två 1 mm hål på motsatta sidor.
2. Skär en 20 mm fyrkant från ett ark med dubbel tejp, och med ett rakblad, skär ut ett 15 x 2 mm avsnitt från centrum.
3. Dra av ena sidan av bandet stöd, och följer bandet till Quartz bild. Iaktta den andra sidan till en functionalized täckglas.
4. Klipp två 20 cm längder av polyeten slang och infoga dem i hålen i kvarts bilden.
5. Täta flödescell med 5 minuters epoxilim.
6. När limmet har härdat, prime flödet cellen och slang med buffert.
7. En stöds membranet kan bildas i detta skede genom att cirka 80 mikroliter av liposomer suspensionen i kanalerna.

Viruspartikeln märkning

1. H3N2 influensa A (X-31) används normalt för fusion analys, men andra influensastammar och andra virus har använts med framgång.
2. Virus är märkta med upp till två olika fluorescerande färger för att möjliggöra upptäckt av hemifusion och por-formation.
3. Lös sulforhodamine b (SRB) i HNE buffert för att göra en 20 mM lösning. Kombinera 20 mikroliter av färglösningen med 10 mikroliter av virala fjädring, och låt stå i rumstemperatur i 20 timmar. Under denna period kommer färga ackumuleras långsamt inne i viruspartiklar.
4. Ta bort överflödig färg genom att skicka den virussuspension genom en PD-10 avsaltning kolumn. Om tillräckligt virus material används, kan ett färgat band syns i kolumnen. Detta band innehåller märkt virus och kan samlas in eftersom det är elueras.
5. Om inget band syns, samla in 200 mikroliter fraktioner och bestämma vilka fraktioner innehåller märkt virus genom att mäta 565 nm absorberas av en spektrofotometer. Viruset ska eluera i en total volym på cirka 0,8 ml.
6. Märk virala kuvertet genom att lägga till 13 mikroliter av 2 mm dimetylformamid (DMF) lösning av oktadecyl Rhodamine 110 (Rh110C18) till SRB märkt virussuspension.
7. Rör suspensionen genom att fästa röret till ett laboratorium rotator och låt stå i 3 timmar.
8. Rena viruset från överskottet Rh110C18 med hjälp av en PD-10 avsaltning kolumn som beskrivits tidigare.

Mikroskop konfiguration

Experimentet utförs på ett fluorescensmikroskop utrustat med en hög NA oljeimmersion mål lämplig för total inre reflektion fluorescensmikroskopi. De 488 och 568 nm rader från en argon / krypton gas laser används för att excitera det Rh110C18 och SRB märkt virus. Samtidig avbildning av varje etikett sker genom att dela upp de gröna och röda fluorescens utsläpp med en dikroisk spegel och självständigt fokusera bilder på olika halvor av en elektron multiplicera CCD-kamera.

Analysen utförs

Genomförande av fusion-analysen innebär en stegvis montering av biokemiska komponenter inom flödescellen: montering av plana membranet, dockning av märkta viruspartiklar, belägga ytan med fluorescein, och inledande av reaktion med lågt pH-buffert (Figur 1A) .

1. Montera flow-cellen på mikroskop scenen, och fäst utloppet slangen till en sprutpump som att flyta med en hastighet av 40 mikroliter per minut.
2. Rensa flödet kanaler av överskjutande liposomer av strömmar i 300 mikroliter av HNE.
3. Fokusera mikroskop och justera lasern makt att belysa ytan med 350 W / cm ² 488 nm ljus och 70 W / cm ² 568 nm ljus. Om du använder en 1,45 NA 60x objektiv oljeimmersion, ställ lasern intensitet till 100 mikro Watts och 20 mikro Watts, respektive.
4. Pump märkt virus (utspädd 1 / 100) i ett flöde cell. Eftersom viruset sprider till botten yta av flödet kanal, kommer partiklarna att börja hålla sig till ganglioside ingår i membranet.
5. När en lämplig täthet av dockad viruspartiklar har uppnåtts (upp till ca 1000 partiklar per synfält). Växla inloppsslang till en lösning som innehåller två mikrogram per milliliter märkt fluorescein streptavidin. Den märkta streptavidin binder till biotin tillsammans lipidmolekyler i tvåskiktsmembran, och så småningom en svagt grön bakgrund kommer att vara synlig.
6. Tvätta flödet kanalen med 300 mikroliter av HNE.
7. Välj en avbildning område, fokusera mikroskop och förbereda CCD-kamera för tiden förföll bild förvärvet. Ställ in exponeringstid till 100 ms och samla in bilder med en hastighet av 10 Hz.
8. Initiera fusion genom flödar i en sur buffert innehållande 10 citrat mM natrium och 140 mM NaCl. PH i bufferten bör justeras till under den kritiska pH viruset analyseras. X-31 säkringar vid pH är under 5,5.

Representativa resultat

Figur 1B visar ögonblicksbilder av tvåskiktsmembran dockad virioner före och under fusion. Varje diffraktion begränsad plats representerar ett enskilt virus partikel. Röd och grön fluorescens har separat avbildat på den övre och nedre halvor av en CCD-kamera, vilket gör att samtidig observation av virus kuvert och etiketter innehåll. Det är vanligtvis dubbelt så många platser i den gröna kanalen jämfört medden röda, och detta återspeglar den lägre effektivitet för märkning av innehållet färgen jämfört med kuvertet etiketten. Den gröna bakgrundsfluorescens avges från ytan bundna fluorescein försvinner vid ankomsten av citratbuffert och tillåter bestämning av starttiden för fusion reaktion. Hemifusion händelser upptäcks som skurar av grön fluorescens som släckte Rh110C18 i det virala kuvertet diffunderar över hemifusion stjälk och späds ut i den plana membran. En utåtriktad växande fluorescerande moln kan ses runt hemifused partiklar, som visar fri spridning av de länkade feta-acyl färgämne i plana membran. Porbildning observeras som sönderfallet av röda fluorescens från SRB instängda i det inre av viruspartiklar. Öppnandet av en fusion por gör färgen att fly in i vattenfasen utrymmet under plana tvåskiktsmembran och ut ur observationen regionen.

Fluorescensintensitet banor för varje partikel, plottade från den integrerade intensitet enskilda partiklar, underlätta fastställande av avkastning och tider hemifusion och porbildning (bild 1C). Hemifusion och porbildning Tider för evenemanget bestäms som den punkt vid vilken den maximala lutningen för en Rh110C18 fluorescens spricka eller SRB-signal förfall inträffar. I ett lyckat experiment, cirka 50 procent av de partiklar märkta med Rh110C18 signaler ger dequenching, och 30 procent av de märkta SRB partiklarna ger användbar signal. Av partiklarna är märkta med både färgämnen, cirka 10 procent visar både lipid blandning och porbildning signaler.

Fig.. 2A-C visar fördelningen av hemifusion och porbildning gånger eftersläpning från en typisk experiment. Fig.2D-F visar vid fördelningen av händelser kombinerat från fem experiment som utförs på samma villkor. Även med ett blygsamt antal observationer, är formen på histogrammen uppenbar. Eftersom varje experiment är synkroniserad med upptäckt av pH-värdet sjunker tiden kan flera experiment kombineras och detaljerad information om hastighetsbegränsande mellanliggande steg kan erhållas.

Figur 1. Experimentell design. A) viruspartiklar är märkta med två fluorescerande färger för att övervaka kinetik hemifusion och fusion porbildning. Fluorescens samlas in av en hög-NA mikroskop mål och avbildas på en CCD. B) Fluorescens bilder före (vänster) och under (höger) fusion av enskilda viruspartiklar. Övre och nedre halvan av varje bild motsvarar de röda och gröna fluorescens, respektive av samma ~ 50 x 100 mm ² område som stöds tvåskiktsmembran. C) Fluorescensintensiteten av den röda SRB viralt innehåll spårämne (övre spår), de gröna Rh110C18 membranet färgämne (mitten spår) och fluorescein pH-sensor (lägre spår) ger exakta tider förflutit mellan pH-värdet sjunker, hemifusion, och fusion. Vänligen klicka här för att se en större version av figur 1.

Figur 2. Fusion kinetik fluorescerande virus. Distributioner av den tid som förflutit mellan pH-värdet sjunker och hemifusion (A, D) och porbildning (B, E). Den uppgång och förfall av distributioner anger att det finns flera mellansteg. Övergången mellan hemifusion och öppnande av en fusion por för enskilda partiklar är exponentialfördelad, vilket tyder på en hastighetsbegränsande steget. Paneler AC visar resultaten från ett enda experiment. Paneler DF sammanställs från fem olika experiment som utförs på samma villkor. Vänligen klicka här för att se en större version av figur 2.

Discussion

Beredning av vätska och kontinuerligt stöd bilayers fett kan vara en utmaning. Spårmängder av kontaminerande material eller ytdefekter kommer att förhindra spridning av bilayers. Noggrann rengöring och deponering av ett enhetligt lager av dextran är viktiga.

Långvarig avbildning av viruspartiklar kan bleka fluorescerande etiketter eller orsaka dem att bli inaktiverat. Bild-skador av detta slag är välkänt i bio-imaging och enda fält molekyl och är allmänt tros härröra från generationen av reaktiva syreradikaler från glada fluoroforer. För att minimera foto-skador, minimerar vi generellt makten excitation laser och undvika långvarig exponering före start av experimentet. Utarmning av syre från buffertar med en av flera syre rapporterade renhållningssystem för kan vara användbar.

Möjligheten att få information om övergående mellanliggande stater kräver att fusionsreaktion exakt ska synkroniseras. Flödet används och de döda volym inloppsslang och flödescell kanal är faktorer som kan begränsa synkroniseringen. Fusion initieras genom att utbyta neutral för surt pH-buffert. Men eftersom sura buffert färdas genom inloppsslang i flödet cellen, blandar gränssnittet mellan två buffertar genom diffusion och blir allt mindre väldefinierade. Den resulterande pH gradient på tvåskiktsmembran ytan tenderar att sudda bestämma starttiden. Eftersom fusion kinetik är beroende av proton koncentration, kan en pH-gradient i början av experimentet försvårar tolkningen av resultaten. I experimentet visade här, är kinetiken av fusion mycket långsammare än pH övergången tid, och den gradient effekt påverkar inte signifikant fusion kinetik. Vi arbetar för närvarande med ändringar av våra flödet celler som skulle tillåta oss att prima inloppsslang med önskad buffert innan avleda flödet i flödet cellen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Corning cover glass squares, 25 mm	Sigma-Aldrich	CLS286525
Fused silica slides	Technical Glass
Staining rack	Thomas Scientific	8542E40
(3- glycidoxypropyl)trimethoxysilane	Gelest Inc.	SIG5840.1
Dextran T-500	Pharmacosmos	5510 0500 4006
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)	Avanti Polar Lipid, Inc	850375
1-palmitoyl-2oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)	Avanti Polar Lipid, Inc	850457
Cholesterol	Avanti Polar Lipid, Inc	700000
N-((6-(biotinoyl)amino)hexanoyl)-1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosph–thanolamine, triethylammonium salt (biotin-X DHPE)	Invitrogen	B1616
Streptavidin, fluorescein conjugate	Invitrogen	S-869
Disialoganglioside GD1a from bovine brain	Sigma-Aldrich	G2392
Mini Extruder	Avanti Polar Lipid, Inc	610000
0.1 micron polycarbonate membrane filters	Whatman, GE Healthcare	800309
10 mm drain discs (membrane supports)	Whatman, GE Healthcare	230300
Sulforhodamine b sodium salt		S1402
Octadecyl rhodamine 110 (Rh110C18)			See Floyd et al. 2008 for synthesis protocol
PD-10 desalting columns	GE Healthcare	17-0851-01
Nikon fluorescence microscope	Nikon Instruments	TE2000-U
Plan Apo TIRF 60x 1.45 NA objective	Nikon Instruments
Innova 70C Spectrum Ar/Kr laser	Coherent Inc.
Syringe Pump	Harvard Apparatus	702213