Summary
De technische aspecten van het uitvoeren van LIPS (Luciferase Immunoprecipitatie Systems) worden beschreven. De algemene benadering bestaat uiten chimere genen die coderen voor antigenen gefuseerd met Renilla luciferase (RUC) in zoogdiercellen. Ruwe Ruc-antigeen extracten worden dan voorbereid en, zonder zuivering, werkzaam in de immunoprecipitatie testen op antilichamen te kwantificeren.
Abstract
Technologieën voor volledig te begrijpen en te kwantificeren antilichaam profielen om autoantigenen en infectieuze agentia kan zorgen voor nieuwe inzichten in ziektemechanismen en kunnen ophelderen nieuwe markers van de ziekte substratify met verschillende klinische kenmerken beter te begrijpen en pathogenese. We hebben een zeer kwantitatieve methode genaamd Luciferase Immunoprecipitatie Systems (LIPS) voor het profileren van de patiënt sera antilichaamrespons tegen autoantigenen en pathogeen antigenen geassocieerd met infectie. In tegenstelling tot de ELISA's, is het zeer gevoelig LIPS gemakkelijk geïmplementeerd om humorale serologische respons profielen onderzoek naar verschillende antigenen in een universeel formaat en produceert dynamische antilichaamtiter bereiken tot 6 loggen
Protocol
1. Schematisch overzicht:
Deze video toont de stappen die betrokken zijn bij het uitvoeren van de LIPS-test. Antigenen zijn uitgedrukt in Cos1 cellen als recombinant Renilla luciferase (RUC)-antigeen fusies, en ruwe extracten worden verkregen en gebruikt zonder zuivering. De LIPS test is een initiatief van incuberen crud e Ruc-antigeen extracten met de patiënt sera in microtiterputjes. Het antilichaam-antigen mengsel wordt vervolgens overgebracht naar een 96-well filter plaat met proteïne A / G kralen om een IgG-moleculen vast te leggen. Na het wassen van de filter plaat met het proteïne A / G kralen, antilichaam gebonden Ruc-antigen wordt gemeten door de toevoeging van coelenterazine ondergrond en lichtunits worden gemeten met een luminometer.
DEEL 1: Transfectie van plasmiden voor de productie van Renilla-Antigen fusieproteïnen
Set-up: Cos1 cellen worden gekweekt in DMEM-10% FCS met behulp van standaard weefselkweek protocollen. Plasmiden voor Renilla luciferase fusies zijn eerder een beschreven. DNA voor deze plasmiden is bereid met behulp van een Midiprep kit van Qiagen. De opbrengst moet ongeveer 1 -3 mg. Meet de DNA-concentratie en opslaan als een 1000 ug / ml stockoplossing bij -20 ° C.
Procedure:
- Een dag voor transfectie, split Cos-1-cellen in de nieuwe 100 x 20 mm gerechten op ongeveer 2 x 10 6 per plaat en incubeer bij 37 ° C.
- Op de volgende dagen, dient de Cos-1-cellen worden 80-95% confluent. Label 1,5 ml polypropyleen microfugebuisje buizen voor elk plasmide DNA getransfecteerd worden. Laat de Fugene-6 transfectiereagens, die wordt opgeslagen bij 4 ° C, op te warmen tot kamertemperatuur.
- Voeg 94 ul van Opti-MEM media aan elke microfugebuis. Voeg vervolgens 6 pl Fugene 6 tot en met de Opti-MEM media zonder het aanraken van de zijwand.
- Incubeer dit mengsel gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 1-2 microgram (van 1mg/ml DNA voorraad) van plasmide voor Renilla luciferase antigen fusieconstruct. Meng en incubeer het mengsel gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Breng de DNA-Fugene 6-Opti-MEM oplossing voor de cellen door druppelen er gelijkmatig in de media van de Cos1 cellen.
DEEL 2: Oogst Renilla-antigeen Fusions
- Twee dagen na transfectie, worden de Cos-1-cellen geoogst. Dit wordt geïnitieerd door het verwijderen van de media en vervolgens het spoelen van de cellen met 6 ml PBS. Na decanteren van de PBS, pipet weg eventuele resterende PBS uit de weefselkweek schotel.
- Voeg 1,4 ml koud lysis buffer bestaat uit 50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl 2, 1% Triton X-100, 50% glycerol en proteaseremmers (2 tabletten van complete miniprotease inhibitor cocktail per 50 ml lysis buffer). Oogst cellen met een cel scrapper en zo snel mogelijk de helft van het lysaat aan elk van de twee 1,5 ml microfugebuisje buisjes op ijs.
- Een Branson Sonifier 150 wordt gebruikt voor het breken van de cellen te openen. Plaats de microcentrifugebuis met het cellysaat op ijs en pols gedurende 5 sec, 5 sec en 5 sec met sonicatie instellingen van 2, 2 en 4, respectievelijk.
- Centrifugeer de cellysaat bij 12.500 RPM voor twee vier minuten draait bij 4 ° C. Na de eerste spin, voorzichtig omkeren van de buizen naar de los bijgevoegde vuil te verwijderen uit de zijwand van de buis. Na de tweede spin, overdracht zorgvuldig het supernatans, zonder verstoring van de pellet, van de twee buizen tot een nieuwe microfugebuis op ijs.
- Het berekenen van de licht-eenheden (GVE) per pi lysaat. Voor het meten van de LU: verdun 1 ui lysaat met 8 pi PBS in een nieuwe microfugebuis. Direct toe te voegen 100 ul van 1X coelenterazine substraat om de verdunde mengsel en onmiddellijk luminescentie te meten in de buis met behulp van een buis luminometer (20/20 n Turner Scientific) met een 5 seconden te lezen.
- Bewaar de Ruc-antigen lysaat bij -20 ° C gedurende 1-2 dagen of op te slaan voor een langere periode van tijd in gelijke fracties bij -80 ° C.
DEEL 3: Voorbereiden van een Sera Master Plate
- Maak een sera meester plaat door eerst toe te voegen 450 ul buffer A (50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl 2, 1% Triton X-100) aan elk putje van een 96-deep-well polypropyleen microtiterplaat . Bij deze stap kan een kleurstof, Phenol Red, ook opgenomen worden in buffer A (uiteindelijke concentratie 0,2 mg / ml in buffer A) op te treden als een tracer voor de bewaking toekomst sera monster toevoegen en andere stappen van de lippen test.
- Voeg vervolgens 50 ul van sera van elk monster naar de verschillende putjes die 450 ul buffer A. Merk op dat dit is een 1:10 verdunning van de sera in buffer A. Typisch sera wordt niet toegevoegd aan de laatste twee putjes van de master-plaat, omdat dit is gereserveerd voor de buffer losse flodders.
- Voor het gebruik van de master plaat, is het uitvoerig geschud (1-2 uur) op een rotator platform. Het serum in de master plaat is staantwoordelijk voor ten minste 1 maand (of langer) bij 4 ° C, indien correct opgeslagen om verdamping te voorkomen.
- Zoals hieronder beschreven, is deze meester plaat geeft 10 ul van de verdunde sera bij herhaling moet worden verwijderd voor profilering van de sera tegen meerdere antigenen. Grotere en kleinere meester platen kunnen ook worden gebruikt. Seal de plaat goed met Parafilm wanneer deze niet wordt gebruikt.
DEEL 4: LIPS-test
- Polypropyleen 96-ondiepe goed microtiterplaten worden gebruikt om sera te testen. In de eerste stap, voeg 40 ul van buffer A aan elke well van de 96-well plaat met behulp van een 8-kanaals micropipet.
- Vervolgens neemt 10 pi van de verdunde sera (1 pi sera equivalent) van de master bord en voeg het direct toe aan elke well van de werkende plaat met behulp van een 8-kanaals micropipet.
- Een meester mix met het Ruc-antigen extract is naast zodanig geformuleerd dat 1 X 10 7 licht-eenheden (GVE) wordt toegevoegd in 50 ul buffer A aan elk putje. Lagere inputs (zo weinig als 1 X 10 6) kan ook worden gebruikt, maar resulteren in een lagere dynamisch bereik. Maak deze meester mengsel en pipet 50 ul van Ruc-antigeen mengsel aan elke well.
- Incubeer de plaat op een rondschudapparaat gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Tijdens de incubatie, voeg 5 ul van een 30% suspensie van Ultralink proteïne A / G kralen (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) in PBS aan de onderkant van elk putje van een nieuwe 96 goed filter HTS plaat (Millipore, Bedford, MA) .
- Na 1 uur incubatie, overdracht van de 100 pi Ruc-antigen antilichaam reactie-mengsel tot 96 goed filter HTS platen die het proteïne A / G kralen met behulp van een 8-kanaals micropipet.
- Incubeer de 96-well filter plaat op een rondschudapparaat voor een extra uur bij kamertemperatuur.
- Was dan het filter plaat op een vacuum spruitstuk. Elk goed is gewassen acht maal met 100 pi buffer A, gevolgd door twee maal met 100 pi PBS. Dit kan handmatig of met een robot pipetteren werkplek worden uitgevoerd.
- Na de laatste wasbeurt, is het vacuüm uitgeschakeld. Verwijder het filter plaat en dep het droog met behulp van een stapel papieren handdoeken of filtreerpapier en zorg ervoor dat vocht te verwijderen op de boven-en onderkant van de plaat.
DEEL 5: Meten Luminescentie en data-analyse
Set-up:
Een Berthold LB 960 Centro microplaat luminometer wordt gebruikt voor het bepalen van luminescentie in elk putje met een enkele injector. Zodra de machine op, spoel de injector met gedestilleerd H 2 O met behulp van de injector wascyclus. Coelenterazine ondergrond is opgesteld volgens de Promega Renilla substraat kit zoals beschreven door de fabrikant. Typisch 6 ml 1X coelenterazine substraat mix (dat wil zeggen 60 ul coelenterazine aandelen plus 6 ml 1X buffer) is voorbereid voor het vullen van de machine en draait een volle 96-well plaat. Voor het analyseren van de plaat, is het Berthold LB 960 Centro microplaat luminometer geprimed met 1X coelenterazine substraat. Open een programma bestand met de instelling voor het injecteren van de ondergrond en het lezen van de plaat. Voor deze metingen werd 50 ul van coelenterazine ondergrond wordt geïnjecteerd, wordt de plaat geschud gedurende 2 seconden, gevolgd door een 5 sec lezen van luminescentie.
- Hoewel de plaat luminometer heeft de capaciteit om de hele plaat te lezen, kan een gedeeltelijke lezen van de plaat ook geselecteerd worden (onder het lezen menu). Start het programma, dat initieert het lezen van de plaat.
- Na de run, onmiddellijk te verwijderen van de microtiterplaat filter plaat te morsen te voorkomen in de luminometer. Exporteer de gegevens die zijn gegenereerd met de MikroWin programma in een Excel-formaat voor analyse.
- Wij raden aan het evalueren van de sera van twee onafhankelijke runs. Gegevens worden vervolgens gemiddeld om de LU titer waarden genereren voor elk monster. Deze waarden kunnen verder worden aangepast aan de buffer blanks af te trekken.
- Bijkomende data-analyse, zoals het bepalen van de cutoff kan worden berekend door het nemen van de gemiddelde plus 3 of 5 standaarddeviaties van de controle-waarden.
Discussion
LIPS vereist een minimale test-optimalisatie en, vanwege de eenvoud, gegevens van hoge kwaliteit kan meestal worden gegenereerd met behulp van LIPS in minder dan twee weken voor een bepaalde antigeen. De meest tijdrovende stappen zijn het klonen en het genereren van de juiste plasmide expressievector die de Ruc-antigen fusie. Zodra deze plasmiden zijn gegenereerd, kunnen een of meerdere antigenen snel getest worden met LIPS zoals hierboven beschreven. Opgemerkt moet worden dat LIPS is heel veelzijdig zodanig dat sera ook kan worden getest in een buis formaat of als alternatief op een microtiter filter plaat met behulp van een robot BIOMEK werkstation 2 of een plaatwasser met vacuüm filtratie. Dit zeer schaalbaar systeem maakt het mogelijk om parallel LIPS profilering van een panel van menselijk autoantigenen 3 of de hele proteoom van een virus 4. Het is waarschijnlijk dat er veel verschillende antilichaam profielen die door LIPS zal nuttig zijn voor diagnostiek 3-9, antigeen ontdekking negen, na het verloop van een behandeling 10, vaccin monitoring en heeft grote gevolgen voor de specifieke ziekte staten en voor de volksgezondheid in het algemeen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd ondersteund door de Intramurale Research Program van de NIDCR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HiSpeed Plasmid Midi KIt | Qiagen | 12643 | |
| 100 x 20 mm tissue culture dishes | Fisher Scientific | 353003 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985 | |
| FuGENE 6 | Roche Group | 1814443 | |
| Complete, Mini protease inhibitor cocktail | Roche Group | 11836153001 | |
| Polypropylene 96 DeepWell 1 ml plate | Fisher Scientific | 12-566-120 | Deep well plate with lid and seal with Parafilm |
| Polypropylene microtiter plate | Fisher Scientific | 12-566-120 | |
| HTS Filter plate | EMD Millipore | MSBVN1B50 | |
| Ultralink Immobilized Protein A/G | Pierce, Thermo Scientific | 53133 (10ml) | |
| Renilla Luciferase Assay System | Promega Corp. | E2820 | For 2000 assays |
| Centro microplate luminometer | Berthold Technologies | LB 960 |
References
- Burbelo, P. D., Goldman, R., Mattson, T. L. A simplified immunoprecipitation method for quantitatively measuring antibody responses in clinical sera samples by using mammalian-produced Renilla luciferase-antigen fusion proteins. BMC Biotechnol. 5, 22-22 (2005).
- Burbelo, P. D., Leahy, H. P., Iadarola, M. J., Nutman, T. B. A Four-Antigen Mixture for Rapid Assessment of Onchocerca volvulus Infection. PLoS Negl Trop Dis. 3, e438-e438 (2009).
- Burbelo, P. D. Sensitive and robust luminescent profiling of anti-La and other autoantibodies in Sj gren’s syndrome. Autoimmunity. 139, 241-245 (2009).
- Burbelo, P. D. Rapid antibody quantification and generation of whole proteome antibody response profiles using LIPS (luciferase immunoprecipitation systems). Biochem Biophys Res Commun. 352, 889-895 (2007).
- Burbelo, P. D., Groot, S., Dalakas, M. C., Iadarola, M. J. High definition profiling of autoantibodies to glutamic acid decarboxylases GAD65/GAD67 in stiff-person syndrome. Biochem Biophys Res Commun. 366, 1-7 (2008).
- Burbelo, P. D. A new luminescence assay for autoantibodies to mammalian cell-prepared insulinoma-associated protein 2. Diabetes Care. 31, 1824-1826 (2008).
- Burbelo, P. D. Serological diagnosis of human herpes simplex virus type 1 and 2 infections by luciferase immunoprecipitation system assay. Clin Vaccine Immunol. 16, 366-371 (2009).
- Burbelo, P. D. Highly quantitative serological detection of anti-cytomegalovirus (CMV) antibodies. Virol J. 6, 45-45 (2009).
- Burbelo, P. D. Four-antigen mixture containing v-cyclin for serological screening of human herpesvirus 8 infection. Clin Vaccine Immunol. 16, 621-627 (2009).
- Ramanathan, R. A luciferase immunoprecipitation systems assay enhances the sensitivity and specificity of diagnosis of Strongyloides stercoralis infection. J Infect Dis. 198, 444-451 (2008).
